Summary
Здесь мы представляем протокол создания коробчатого дефекта в бедренной диафизной ткани крысы. Эта модель позволяет оценить характеристики биоматериала при биомеханических нагрузках и изучить механизмы регенерации кости, связанные с внутримембранозным остеогенезом.
Abstract
Серьезные костные дефекты или сложные переломы могут привести к серьезным осложнениям, таким как несращение или недостаточное заживление кости. Тканевая инженерия, которая включает в себя применение клеток, скаффолдов и цитокинов, считается многообещающим решением для регенерации костей. Следовательно, различные животные модели, которые имитируют костные дефекты, играют решающую роль в изучении терапевтического потенциала тканевой инженерии для заживления костей. В этом исследовании мы создали коробчатую модель кортикального костного дефекта в средней части бедренной кости крыс, которая может служить идеальной моделью для оценки функции биоматериалов в содействии заживлению костей. Этот коробчатый дефект кортикальной кости был просверлен с помощью орального низкоскоростного наконечника и сформирован иглой токарного станка. Сразу же был проведен послеоперационный микрокомпьютерный анализ для подтверждения успешного установления коробчатого дефекта кортикальной кости. Бедренные кости на прооперированной стороне крыс затем были собраны в несколько временных точек после операции (0 дней, 2 недели, 4 недели и 6 недель). Процесс заживления участка дефекта каждого образца оценивали с помощью микрокомпьютерной томографии, окрашивания гематоксилином и эозином (H&E), а также трихромного окрашивания по Массону. Эти результаты продемонстрировали характер заживления, соответствующий внутримембранозному окостенению, при этом заживление практически завершилось к 6 неделям. Категоризация процесса заживления этой животной модели обеспечивает эффективный метод in vivo для исследования новых биоматериалов и лекарств, которые нацелены на внутримембранозную оссификацию во время заживления дефектов костной ткани.
Introduction
Переломы и дефекты кости часто являются результатом травм, опухолей, воспалений и врожденных пороков развития 1,2. Несмотря на то, что костная ткань у молодых здоровых людей обычно обладает устойчивыми регенеративными способностями3, дефекты, превышающие критический размер, или препятствия заживлению из-за системных заболеваний (например, диабета, остеопороза и инфекций) все же могут привести к осложнениям, таким как разрыв кости илинарушение заживления. Для решения этой клинической проблемы обычно используется костная пластика или биоматериалы для замены сильно поврежденной кости или для реконструкции больших сегментов кости. Однако эти методы лечения имеют ограничения. Например, несмотря на то, что аутологичная костная пластика считается золотым стандартом, она страдает от ограниченного донорского предложения и потенциальных осложнений со стороны донорского участка 5,6. Аллотрансплантаты также представляют определенные риски, такие как иммуноопосредованное отторжение, потенциальная передача заболеваний и негативное воздействие на биомеханические и биологические свойства трансплантата7.
В последние годы наблюдается всплеск исследований, посвященных механизмам заживления костных дефектов. Использование альтернативных биоматериалов и достижения в области тканевой инженерии стали важными темами в области регенерации костей8. Прежде чем эти биоматериалы можно будет применять в терапии человека, они должны быть протестированы in vitro и in vivo, чтобы убедиться в их эффективности и безопасности. Тем не менее, пониженная сложность сред in vitro и отсутствие иммунных и воспалительных реакций ограничивают оценку различных биоматериалов in vitro. Следовательно, необходимо создание животных моделей для различных типов дефектов костной ткани9. Животные модели позволяют оценивать биоматериалы при различных условиях нагрузки, облегчают понимание видоспецифичных характеристик костей и дают представление о сходстве между животными моделями и клиническими ситуациями человека. Эти преимущества имеют важное значение для изучения взаимодействия кости и каркаса и перевода результатов исследований в клиническую практику 9,10.
В настоящее время для валидации характеристик биоматериалов широко используются животные модели механических костных дефектов, при этом наиболее часто применяемымиметодами являются модели черепных дефектов костей и модели сегментарных костных дефектов. Модели сегментарных костных дефектов, часто используемые для имитации тяжелой травмы длинной кости или большеберцовой кости, заканчивающейся несращением кости, являются предпочтительными благодаря своим однородным размерам и определенным анатомическим положениям, что упрощает рентгенологическую или гистологическую оценку формирования новой кости и реваскуляризации. Тем не менее, эти модели требуют металлических имплантатов для стабилизации сегментов двустороннего перелома и требуют сложного процесса заживления, включающего как эндохондральное, так и внутримембранозное окостенение. С другой стороны, модели дефектов костей костей стали основным инструментом скрининга для оценки биоматериалов благодаря их стандартизированным диаметрам дефектов, удобному хирургическому доступу и поддерживающей функции твердой мозговой оболочки и мягких тканей13. Несмотря на то, что они широко используются для моделирования внутримембранозного формирования кости в клинически значимых сценариях, они не подходят для оценки заживления кости в условиях биомеханической нагрузки из-за их ненесущей природыв процессе заживления.
Чтобы устранить эти ограничения, мы создали модель коробчатого дефекта кортикальной кости в бедренной диафизной ткани крыс. Используя трехмерную (3D) реконструкцию с помощью микрокомпьютерной томографии (КТ) и гистопатологического окрашивания (гематоксилин и эозин [HE] и Массона), мы проанализировали процесс заживления этой модели в условиях гемостаза. Мы стремимся предложить новые идеи для оценки характеристик биоматериала в условиях биомеханической нагрузки, а также для изучения биоинженерии и механизма регенерации кости в условиях внутримембранозного окостенения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2021-597). Для настоящего исследования использовались крысы Спрэг-Доули (самец, масса тела 300 г).
1. Предоперационная подготовка
- Подготовка инструмента
- На рисунке 1А приведены хирургические инструменты, использованные в данном исследовании: электробритва, тканевые ножницы, офтальмологические ножницы, офтальмологические щипцы, одноразовый скальпель, надкостничный сепаратор, оральный низкоскоростной наконечник, оральный зонд, одноразовый пылесос для ирригации, иглодержатель, шов 3.0.
- Подготовьте оральный зонд и отметьте маркером большой изогнутый конец зонда в соответствии с диаметром дефекта (рисунок 1В). Используйте это для определения размера дефекта во время операции.
- Перед использованием стерилизуйте все хирургические материалы и инструменты, используемые для выполнения процедуры. Упакуйте нужные материалы в сложенную ткань или оберточную бумагу и заклейте их автоклавной лентой для стерилизации паром (125-135°C в течение 20-25 минут).
- Подготовка хирургической зоны: Продезинфицируйте операционный стол и окружающую среду путем распыления 75% спирта. Создайте стерильную зону размером примерно 60 см x 90 см с помощью автоклавных простыней на операционном столе.
- Подготовка к анестезии
- Обезболивают крыс внутрибрюшинно 10% кетамина гидрохлоридом (50-100 мг/кг) и 2% ксилазином 2 мг/кг). Используйте подкожное введение карпрофена (5 мг/кг) для предоперационной и интраоперационной анальгезии. Исследуйте глубину анестезии с помощью теста с зажимом пальца ноги. После анестезии нанесите на глаза стерильную глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз и травмирование роговицы.
2. Хирургическое вмешательство
- Поместите крысу в боковое лежачее положение на стерильный операционный стол и удалите волоски нижних конечностей с помощью электробритвы.
- Используйте 5% раствор йодофора и 75% спирт для дезинфекции кожных тканей в области операции.
- Найдите проксимальный и дистальный отделы бедренной кости и сделайте разрез длиной 2,5 см вдоль длинной оси бедренной кости, чтобы разрезать кожную ткань крысы.
- Отделите слой кожи от фасции с помощью офтальмологических щипцов и тканевых ножниц и обнажите латеральный доступ к бедренной кости через бицепс бедра и боковые мышцы бедра.
- Найдите место пересечения двух мышечных перегородок (белая тканевая линия) и осторожно разделите одноразовым хирургическим лезвием вдоль мышечной границы, пока не будет достигнута бедренная поверхность.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании одноразового лезвия для разделения мышцы важно отделить мышцу вдоль мышечной перегородки и быть осторожным, чтобы не вызвать повреждение сосудов в мягких тканях. Новички и те, кто не знаком с анатомией, должны использовать офтальмологические щипцы и надкостничные разделители при тупом рассечении между двумя мышечными массивами.
- Примените надкостничный сепаратор, чтобы тупо отделить мышцы бедренной поверхности и обнажить середину бедренного диафиза.
- Стерильным маркером отметьте участок дефекта на средней поверхности бедренного диафиза, расположенный в верхней части латерального 1/3 косого гребня головки бедренной кости.
- Используйте оральный низкоскоростной наконечник с замедленным шариковым сверлом диаметром 1,2 мм, чтобы просверлить небольшое отверстие перпендикулярно поверхности кости в отмеченном месте, разрушая надкостницу и кору кости на глубину, достаточную для достижения полости костного мозга. На этом уровне глубины сверления расширяем размер отверстия параллельно этой глубине во всех направлениях, обрезая для достижения формы короба-полости.
- Используйте меченый пероральный зонд параллельно краю дефекта, чтобы определить диаметр и морфологию дефекта во время и после подготовки.
- Закройте мышечный и кожный слои рассасывающимися нитями 3-0 мононити соответственно и продезинфицируйте операционную область 5% йодофором изнутри наружу.
3. Послеоперационный уход
- После операции введите карпрофен (5 мг/кг) подкожно и положите крысу на грелку постоянной температуры до восстановления после анестезии. Когда крыса придет в себя, осторожно переместите ее в клетку, содержащую сухую автоклавную подстилку.
- Продолжайте обезболивание в течение 24 ч и послеоперационное наблюдение в течение 1 недели после операции.
4. Сбор и анализ проб
- Гуманно усыпить крысу после операции путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия 100-200 мг/кг. Аккуратно отделите мышечную и фасциальную ткань на поверхности бедренной кости и полностью удалите бедренную кость на прооперированной стороне. Образцы собирают через 0 дней (рис. 2A, B), через 2 недели, 4 недели и 6 недель после операции.
- Зафиксируйте образцы бедренной кости в 4% параформальдегиде на 24 ч. Анализируют структуру бедренной кости с помощью микрокомпьютерной томографии. Установите следующие параметры сканирования: потенциал рентгеновской трубки, 70 кВ; фильтр, AL 0,5 мм; Интенсивность рентгеновского излучения, 0,2 мА; размер вокселя 17 мкм; и время интегрирования, 1 × 300 мс. Реконструируйте изображения 3D-модели с использованием растровых данных.
- Декальцинируйте образцы в 10% ЭДТА в течение 8 недель перед обезвоживанием образцов бедренной кости в дифференцированной серии разведений этанола. Затем погрузите образцы в парафин15.
- Разрежьте залитые образцы на парафиновые срезы размером 5 мкм из сагиттальной плоскости.
- Окрашивание срезов с помощью набора для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и набора для окрашивания Masson. Наблюдайте за заживлением участка дефекта с помощью гистопатологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе мы успешно устанавливаем с помощью сверления модель коробчатого дефекта бедренной кости крысы размерами 4,5 мм х 1,5 мм. Чтобы проанализировать процесс заживления, мы собрали бедренную ткань на прооперированной стороне через 0 дней, 2 недели, 4 недели и 6 недель после операции, которые являются ключевыми временными точками эндохондрального окостенения, внутримембранозного окостенения и ремоделирования кости в процессе заживления бедренной травмы у крыс2. На 0-е сутки после операции реконструкция 3D-модели по данным растровой карты микро-КТ показала, что мы успешно смоделировали коробчато-полостной дефект бедренной кости глубиной 4,5 мм х 1,5 мм до полости костного мозга (рис. 3А). Результаты микрокомпьютерной томографии показали образование минерализованной трабекулярной кости в интерстициальном пространстве кортикального костного дефекта через 2 недели после создания модели (рис. 3В). Поверхность новой костной ткани в области дефекта показала зрелую, плотную кортикальную кость, а трабекулярная костная ткань все еще была видна на медуллярной стороне через 4 недели после операции (Рисунок 3C). Через 6 недель область дефекта почти полностью состояла из зрелой, плотной кортикальной кости, с небольшим количеством трабекулярной костной ткани, оставшейся вблизи медуллярной стороны, что указывает на то, что область дефекта в основном зажила (Рисунок 3D).
Мы также анализируем собранные образцы с помощью H&E окрашивания и трихромного окрашивания Массона (рис. 4). Результаты показали, что через 2 недели после операции в области дефекта сформировалась наивная трабекуляроподобная костная ткань, а надкостница вокруг области дефекта утолщелась и соединилась с трабекулярной костной тканью новорожденного в области дефекта (рис. 4A,A',B,B'). Через 4 недели после создания дефекта на поверхности участка дефекта формировалась плотная кортикальная костная ткань, которая соединялась с кортикальной костью с обеих сторон дефекта; трабекуляроподобная костная ткань была сильно резорбирована на медуллярной стороне (рис. 4C,C',D,D'). Зрелая кортикальная костная ткань была сформирована в области дефекта, а трабекулярная костная ткань на медуллярной стороне была почти полностью резорбирована через 6 недель после операции (рис. 4E,E',F,F'), что указывает на то, что процесс заживления дефекта был почти завершен.
Рисунок 1: Инструменты, необходимые для создания дефекта. (A) Хирургические инструменты. (1) Электробритва; (2) Офтальмологические щипцы; (3) Офтальмологические ножницы; (4) Одноразовый скальпель; (5) Периостальный сепаратор; (6) Оральный низкоскоростной наконечник; (7) Модифицированный оральный зонд; (8) Одноразовый пылесос для орошения; (9) Иглодержатель; (10) Тканевые ножницы; (11) Шов 3.0. (В) Оральные зонды с маркировкой размеров диаметра дефекта. Большой изогнутый конец стерильного одноразового орального зонда был помечен шкалой 1,5 мм и 4,5 мм для интраоперационного измерения диаметра участка дефекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Морфология дефекта коробчатой полости (день 0). (A,B) Измерение образцов после операции в день 0 с использованием модифицированного орального зонда, который был использован для создания дефекта коробчатой полости (4,5 мм x 1,2 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Микрокомпьютерная томография процесса заживления области дефекта. 3D-реконструированные изображения области дефекта через 0, 14, 28 и 42 дня после операции. (А) Продольная плоскость. (Б-Г) Продольные (левая панель), сагиттальные (посередине) и поперечные (правая панель) микрокомпьютерные томографии заживления области дефекта через 14, 28 и 42 дня. Желтая пунктирная рамка в точках A, B, C и D представляет собой область дефекта. Желтая пунктирная линия обозначает края дефекта, а желтая стрелка представляет новую костную ткань в области дефекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Гистопатологические результаты. (А-Ж) H&E и Masson окрашивание участка дефекта через 14 дней, 28 дней и 42 дня. (А'-Ф') Увеличенные изображения черных прямоугольных коробок, показанные в цветах A-F. Трабекуляроподобная минерализованная костная ткань формировалась в области дефекта через 14 суток после операции; Кортикальная костная ткань формировалась на поверхности участка дефекта и соединялась с обоими концами участка дефекта через 28 дней после операции; Зрелая кортикальная костная ткань была сформирована в области дефекта через 42 дня после операции, и заживление было в основном завершено. Синей пунктирной линией обозначен край дефекта; область, обведенная красной пунктирной линией, — это новая костная ткань в области дефекта; черная стрелка — утолщенная надкостница; желтый треугольник — это старая корковая кость; Зеленая стрелка — это новая трабекулярная костная ткань; Черная и желтая звезды — это новая корковая костная ткань; А красная стрелка – это новая надкостница. Масштабные линейки: 500 μм (A-F), 200 μм (A'-F'). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доклинические модели на животных жизненно важны для изучения заживления костей и влияния биоматериалов на регенерацию костей. Этот протокол иллюстрирует модель дефекта коробчатой полости бедренной кости, воспроизводящую процесс внутримембранного формирования кости, связанный с клинической регенерацией кости. Область дефекта была интраоперационно стандартизирована с помощью предварительно маркированного орального зонда. Результаты микрокомпьютерной томографии и гистопатологического окрашивания показали прогрессирующее заживление в течение 6 недель, с утолщением надкостницы и образованием новой трабекулярной кости с последующим формированием плотной кортикальной кости. В процессе заживления хрящевой ткани не наблюдалось, что указывает на внутримембранозный остеогенез. Это открытие открывает новые перспективы для изучения роли биоматериалов или лекарств в клинической регенерации костей.
Этот протокол требует тщательного внимания к нескольким факторам: (i) Глубокая анестезия является необходимым условием для предотвращения дистресса животного и обеспечения точной локализации дефекта. Следует внимательно следить за глубиной анестезии и жизненно важными показателями. (ii) Во время разделения мышц следует уделять пристальное внимание предотвращению повреждения сосудов, которое может затруднить восстановление. (iii) При подготовке отверстия для дефекта сохраняйте правую точку опоры стабильной и всегда перпендикулярной поверхности кости, чтобы убедиться, что дефект коробки находится на той же глубине. Глубину сверла следует контролировать, чтобы удалить кортикальную костную ткань без чрезмерного углубления. Это позволяет избежать задержки заживления кости из-за чрезмерного механического разрушения костного мозга, что приводит к удалению мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и нарушению воспалительной реакции16. (iv) Препарирование полости требует от ассистента непрерывного орошения области физиологическим раствором для смягчения потенциального повреждения тканей, вызванного теплом во время абляции кости, сохраняя при этом видимость операционного поля.
Модели переломов костей, сегментарных костных дефектов и черепных костей являются широко используемыми животными моделями для исследования регенерации костей. Модель перелома кости отражает реальный процесс травмы, но результаты могут отличаться из-за различий в сечениях переломов у экспериментальных животных17. Модель сегментарного костного дефекта эффективно моделирует осложнения перелома, такие как несращение или замедленное заживление. Благодаря своему анатомическому расположению эта модель облегчает оценку образования новой кости и реваскуляризации с помощью рентгенологических или гистологических методов18. Тем не менее, этот метод представляет собой значительные различия в размерах дефектов у разных субъектов; Требование фиксации шины или внутренней фиксации металлическими имплантатами также ограничивает его применение11. Модель черепного дефекта характеризуется отсутствием внутренней фиксации, высокой воспроизводимостью по размеру и анатомическому положению, а также стабильной механической средой14, что также ограничивает ее применение при оценке биологической реакции на физиологическую, биомеханическую нагрузку имплантируемого материала13. Более того, при отсутствии трансплантата кости вторжение в дефект твердой мозговой оболочки и вышележащих мягких тканей может препятствовать регенерации кости, что делает эти модели чувствительными к характеристикам материала каркаса18. Таким образом, данный протокол предлагает установление коробчатого дефекта в бедренном диафизе крысы, что позволяет проводить интраоперационное измерение диаметра дефекта с помощью простого инструмента18. Такой подход обеспечивает лучший контроль над стандартизацией дефектов по сравнению с моделями с переломами или сегментарными дефектами и устраняет необходимость во внутренней или внешней фиксации. Кроме того, эта модель устойчива к нарушениям костного образования из-за эрозии мягких тканей. Этот протокол, однако, имеет определенные ограничения: (i) Неправильное выполнение или чрезмерный диаметр дефекта могут привести к сильному кровотечению, шоку или даже летальному исходу у крыс. Таким образом, чтобы обеспечить безопасность и благополучие животных, необходимо потренироваться с трупами крыс перед выполнением процедуры на живых субъектах. (ii) Кроме того, отсутствие системы Гаверса в коре головного мозга19 грызунов затрудняет полное воспроизведение естественного клинического процесса заживления переломов/дефектов костей человека. Крысы, как и грызуны, экономичны, требуют минимального обслуживания, безопасны и просты в обращении, обеспечивая более высокую воспроизводимость, чем более крупные животные, такие как кролики, собаки и козы.
Таким образом, мы разработали модель коробчатого дефекта бедренной полости бедренной кости крысы и отслеживали процесс заживления с использованием методов микрокомпьютерной томографии и гистопатологического окрашивания. Этот протокол представляет собой комплексный и обобщающий метод для изучения внутримембранозного формирования костной ткани в рамках клинически значимых моделей регенерации кости. Кроме того, предлагаются инновационные перспективы для оценки биологической эффективности замещающих биоматериалов, препаратов, связанных с регенерацией костей, скаффолдов и т.д. Это также облегчает доклиническую валидацию новых терапевтических стратегий для инженерии костной ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все исходные данные и изображения включены в эту статью. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Acknowledgments
Это исследование финансировалось грантами Национального фонда естественных наук Китая 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) и 82100982 (F. L.) и поддерживалось Сычуаньской научно-технической программой 2023NSFSC1499 (H. W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193 (2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66 (2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084 (2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977 (2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
