Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.
Abstract
Die Entwicklung synthetischer Biomarker für die Entwicklung von Präzisionsdiagnostika hat die Erkennung von Krankheiten über Wege ermöglicht, die über die für herkömmliche Biofluidmessungen verwendeten hinausgehen. Synthetische Biomarker verwenden im Allgemeinen Reporter, die lesbare Signale in der Bioflüssigkeit liefern, um die biochemischen Veränderungen in der lokalen Krankheitsmikroumgebung während des Auftretens und Fortschreitens der Krankheit widerzuspiegeln. Die pharmakokinetische Konzentration der Reporter und die biochemische Amplifikation des Krankheitssignals sind von größter Bedeutung, um eine hohe Sensitivität und Spezifität in einem diagnostischen Test zu erreichen. Hier wird eine Krebsdiagnoseplattform mit einem Format synthetischer Biomarker aufgebaut: aktivitätsbasierte Nanosensoren, die chemisch stabilisierte DNA-Reporter tragen, die durch aberrante proteolytische Signaturen in der Tumormikroumgebung freigesetzt werden können. Synthetische DNA als Krankheitsreporter bietet Multiplexing-Fähigkeit durch ihre Verwendung als Barcode, die das gleichzeitige Auslesen mehrerer proteolytischer Signaturen ermöglicht. DNA-Reporter, die in den Urin freigesetzt werden, werden mit Hilfe von CRISPR-Nukleasen durch Hybridisierung mit CRISPR-RNAs nachgewiesen, die wiederum bei Enzymaktivierung ein fluoreszierendes oder kolorimetrisches Signal erzeugen. In diesem Protokoll werden DNA-Barcode-basierte, aktivitätsbasierte Nanosensoren konstruiert und ihre Anwendung in einem präklinischen Mausmodell für metastasierenden Darmkrebs veranschaulicht. Dieses System ist je nach Krankheitsbiologie in hohem Maße modifizierbar und erzeugt mehrere Krankheitssignale gleichzeitig, was ein umfassendes Verständnis der Krankheitsmerkmale durch einen minimalinvasiven Prozess ermöglicht, der nur die Verabreichung von Nanosensoren, die Urinsammlung und einen Papiertest erfordert, der eine Point-of-Care-Diagnostik ermöglicht.
Introduction
Trotz der erheblichen Anstrengungen, Tumor-Biomarker wie abgestoßene Proteine und DNA zu identifizieren, wurde das Feld der Krebsdiagnostik durch ihre geringe Häufigkeit oder ihren schnellen Abbau im Kreislauf belastet1. Als ergänzende Strategie stellen biotechnologisch hergestellte synthetische Biomarker, die selektiv auf Krankheitsmerkmale reagieren, um verstärkte Signale zu erzeugen, neue Wege zu einer genauen und zugänglichen Diagnostik dar 2,3. Um die Erkennung zu unterstützen, nutzen diese synthetischen Biomarker tumorabhängige Aktivierungsmechanismen wie die enzymatische Amplifikation, um Analyten mit verbessertem Signal-Rausch-Verhältnisherzustellen 4. Hierbei wird eine Klasse von krebsassoziierten Enzymen, Proteasen, genutzt, um injizierbare nanoskalige Sensoren zu aktivieren, um Krankheitsreporter freizusetzen, die aus den Bioflüssigkeiten wie Blut oder Urin nachweisbar sind 5,6. Angesichts der Tumorheterogenität ermöglicht die Entwicklung eines Panels von Protease-aktivierten Sensoren Multianalyttests, die verschiedene Protease-Spaltungsereignisse zu einer "Krankheitssignatur" kombinieren, um die Krebsinzidenz und -progression auf spezifischere, multiplexe Weise zu bewerten.
Es wurden Protease-aktivierte synthetische Biomarker entwickelt, die Peptidsubstrate umfassen, die an die Oberfläche eines inerten Trägerskonjugiert sind 7. Wenn diese Peptide in vivo injiziert werden, werden sie zum Tumor transportiert, woraufhin die enzymatische Spaltung durch Tumorproteasen Reporter zum Nachweis in Blut oder Urin freisetzt. Der Multiplex-Nachweis mit Protease-aktivierten synthetischen Biomarkern erfordert, dass jeder synthetische Biomarker in einem Cocktail mit einem eindeutigen molekularen Barcode gekennzeichnet wird. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Ansätze entwickelt, darunter Massen-Barcodes und ligandenkodierte Reporter 8,9,10. Im Gegensatz zu diesen Multiplexing-Methoden, die auf wenige verschiedene Signalmöglichkeiten beschränkt sein können, bietet DNA-Barcoding viel mehr Kombinationen, die der hohen Komplexität und Heterogenität menschlicher Krankheitszustände entsprechen. Um die Multiplexität synthetischer Biomarker zu erweitern, werden die Sensoren mit einem Barcode versehen, indem jeder Reporter mit einer eindeutigen DNA-Sequenz markiert wird, die über die CRISPR-Cas-Nuklease nachgewiesen werden kann, um das biofluidische Signal ex vivo zu verstärken. Diese einzelsträngigen DNA-Barcodes (ssDNA) sind so konzipiert, dass sie an komplementäre CRISPR-Guide-RNAs (crRNAs) binden und die zielgesteuerte kollaterale Nukleaseaktivität von CRISPR-Cas12aaktivieren 11. Diese Nukleaseaktivität kann verwendet werden, um einen Reporter-DNA-Strang zu spalten, der durch Fluoreszenzkinetik oder unter Verwendung von Papierstreifen nachgewiesen wird.
Neben der molekularen Amplifikation über Proteasen (in vivo) und CRISPR-Cas (ex vivo) besteht ein weiteres wichtiges Designmerkmal von Protease-aktivierten synthetischen Biomarkern darin, die Pharmakokinetik von Nanomaterialien zu nutzen, um die diagnostische Signalkonzentration in Bioflüssigkeiten zu erhöhen10. Ein Ansatz ist die Verwendung eines Nanopartikelträgers, um die Zirkulationszeit von oberflächenkonjugierten Peptidsubstraten zu erhöhen. Ein Polyethylenglykol (PEG)-Dendrimer wird als Nanocarrier mit relativ kleinem hydrodynamischem Durchmesser und Multivalenz ausgewählt, um die Abgabe an Tumore zu erhöhen. Obwohl er klein genug ist, um die Tumorabgabe zu fördern, ist die Größe des PEG-Trägers größer als der ~5-nm-Grenzwert der glomerulären Nierenfiltrationsbarriere, so dass nur gespaltene Peptidsubstrate in den Urin ausgeschieden werden können, wobei die Größenfiltration durch die Nieren genutzt wird12. In diesem Protokoll wird der mehrstufige Arbeitsablauf für die Synthese und Anwendung von DNA-barcodierten aktivitätsbasierten Nanosensoren in einem präklinischen Mausmodell skizziert, wobei der Aufbau des CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Tests hervorgehoben wird, der von dieser Gruppe zur Klassifizierung des Krankheitsstatus in Mausmodellen mehrerer Krebsarten eingesetzt wurde13. Aufgrund des vielseitigen Designprinzips können alle drei Funktionskomponenten des Nanosensors - der Nanocarrier (PEG-Polymer), das stimuli-responsive Modul (Protease-aktiviertes Substrat) und der biofluidische Reporter (DNA-Barcode) - je nach anwendungsspezifischen Anforderungen präzise ausgetauscht werden, was eine Modularität durch maßgeschneiderte Ziel- und Freisetzungsspezifitäten ermöglicht.
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Protocol
Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Einrichtung der Autoren genehmigt. Standard-Tierpflegeeinrichtungen wie Haltungskammern, sterile Hauben, Anästhesie und ethische Endpunkt-Euthanasie sind erforderlich, um diese Experimente ordnungsgemäß durchzuführen. Alle Experimente werden in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt und vom tierärztlichen Personal der Einrichtung überwacht. Weibliche BALB/c-Mäuse, die für die Experimente verwendet wurden, stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle) und waren zu Beginn der Studie zwischen 6 und 8 Wochen alt. Sequenzen für kundenspezifisch synthetisierte DNA, crRNA, FRET-basierte Peptidsubstratsonden und Sensorpeptide sind in der ergänzenden Tabelle 1 enthalten.
1. Protease-aktivierte Peptidsubstratauswahl
- Entnahme und Aufbereitung von Gewebeproben aus gesunder Lunge oder Lungengewebe mit Tumorknoten nach einem zuvor veröffentlichten Bericht13.
- Homogenisieren Sie Gewebe in vorgekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) (200 mg Gewebe/ml PBS) mit Gewebedissoziationsröhrchen für die automatisierte Dissoziation von Geweben in Einzelzellsuspensionen.
- Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 6.000 x g für 5 min bei 4 °C. Bewahren Sie den Überstand in einem neuen Röhrchen auf.
- Der Überstand wird bei 14.000 x g 25 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie der Probe PBS hinzu, um eine Lösung von 0,33 mg/ml herzustellen.
- Beurteilen Sie die proteolytische Aktivität anhand der folgenden Schritte.
- Geben Sie in einer 384-Well-Platte 5 μl, 6 μM FRET-basierte Peptidsubstratsonden in jedes Well. Führen Sie die Reaktion für jede Sonde in dreifacher Ausführung durch.
HINWEIS: Die FRET-basierte Peptidsubstratsonde enthält eine kurze Peptidsequenz (6-8 Aminosäuren, die spezifisch für eine Zielprotease oder eine Gruppe von Proteasen sind), die mit einem Fluorophor- und Quencherpaar abgeschlossen ist. Zwei FRET-Sonden sind in der ergänzenden Tabelle 1 beispielhaft beschrieben. Die vollständige Bibliothek der Sonden finden Sie in Hao et al.13. Urheberrecht - Zentrifugieren Sie die Well-Platte 10 s lang bei Raumtemperatur bei 180 x g , um sicherzustellen, dass sich die Sonden am Boden der Platte befinden.
- Geben Sie 25 μl 0,33 mg/ml Gewebeprobe oder 40 μM rekombinante Protease13 in jede Vertiefung.
HINWEIS: Die Endkonzentration der Gewebeprobe oder der rekombinanten Protease muss möglicherweise entsprechend ihrer intrinsischen proteolytischen Aktivität optimiert werden. Beispielsweise können stark proteolytische Gewebe wie der Darm höhere Verdünnungsfaktoren erfordern, um die anfängliche enzymatische Spaltung überwachen zu können. - Zentrifugieren Sie die Well-Platte kurz bei 180 x g (bei Raumtemperatur), um die Sonden und Gewebelysate zu mischen.
- Beginnen Sie sofort mit der Erkennung der Sondenspaltung, indem Sie die Fluoreszenz mit dem Plattenlesegerät bei 37 °C alle 2 Minuten für 1 h (λz. B. 485 nm; λem: 535 nm) messen, um die Spaltung zu überwachen.
HINWEIS: Verwenden Sie die entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen für bestimmte Fluorophor- und Quencherpaare. Im Falle dieser Studie werden Parameter (λex: 485 nm und λem: 535 nm) für das FAM-Fluorophor festgelegt. - Um die fluoreszierenden Messdaten zu analysieren, verwenden Sie das Python-Paket (siehe Materialtabelle) für die Analyse der Enzymkinetik, das unter https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic verfügbar ist. Dieses Skript berechnet die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit (V0) anhand der Steigung der linearen Anpassung der ersten 8-10 Anfangszeitpunkte.
- Geben Sie in einer 384-Well-Platte 5 μl, 6 μM FRET-basierte Peptidsubstratsonden in jedes Well. Führen Sie die Reaktion für jede Sonde in dreifacher Ausführung durch.
2. Sensorformulierung und -charakterisierung
- Synthetisieren Sie das Konjugat von DNA und Protease-aktiviertem Peptid (PAP).
- Inkubieren Sie 20-mer-phosphorothioierte DNA-Reporter mit 3'-DBCO-Gruppe (1,1 Äq., siehe Materialtabelle) mit azidterminierten PAPs mit C-terminus-Cystein-Ende in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei Raumtemperatur für >4 h. Bei Übernacht bei 4 °C inkubieren.
- Reinigen Sie das Produkt auf einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-System (HPLC), das mit einer Säule ausgestattet ist, die sich ideal für Biomoleküle eignet (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den HPLC-Gradienten so ein, dass er bei 5 % A-Puffer (0,05 % TFA in H2O) beginnt, 20 Minuten lang isokratisch bleibt und 80 % B-Puffer (0,05 % TFA, 99,95 % Acetonitril) bei 65 Minuten mit einer Flussrate von 0,3 ml min-1 erreicht, und sammelt das konjugierte Produkt mit einer Retentionszeit von ~31 min.
- Validieren Sie die gereinigten Konjugate durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) unter Verwendung von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix14 (siehe Materialtabelle).
- Synthetisieren Sie die DNA-kodierten aktivitätsbasierten Nanosensoren.
- 2 mg multivalentes PEG (40 kDa, 8-armig, siehe Materialtabelle) mit Maleimid-reaktiver Gruppe in 1 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) und Filter (Cutoff: 0,2 μm) lösen.
- Geben Sie die Cystein-terminierten DNA-Peptid-Konjugate (2 Gl., siehe Materialtabelle) in das PEG und reagieren Sie bei Raumtemperatur für >4 h. Bei Übernacht bei 4 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die nicht konjugierten Materialien mittels Größenausschlusschromatographie mit einer handelsüblichen Dextran-Agarose-Kompositmatrixsäule auf einer schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) (siehe Materialtabelle). Führen Sie Proben in PBS durch und überwachen Sie die Absorption bei 260 nm für DNA und 280 nm für Peptid.
- Konzentrieren Sie die synthetisierten Nanosensoren mit Zentrifugalfilterröhrchen (MWCO = 10 kDa) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Geschwindigkeit (siehe Materialtabelle).
- Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem ssDNA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) und einem Plattenlesegerät bei λz. B. 485 nm und λem: 535 nm. Lagern Sie die Nanosensoren bei 4 °C.
- Charakterisieren Sie die DNA-kodierten aktivitätsbasierten Nanosensoren.
- Messen Sie die hydrodynamische Partikelgröße von DNA-kodierten Nanosensoren durch dynamische Lichtstreuung (DLS).
HINWEIS: Der erwartete Größenbereich von Nanosensoren beträgt 15-50 nm mit einer durchschnittlichen Größe von 20-30 nm. Wenn ein begrenzter Größenbereich gewünscht wird, kann FPLC (in Schritt 2.3) verwendet werden, um schmalere Fraktionen mit unterschiedlichen Molekulargewichten zu isolieren. - Konzentrieren Sie die Nanosensoren mit Zentrifugalfilterröhrchen (MWCO = 10 kDa) auf 0,5 mg/ml (nach DNA-Konzentration) und laden Sie die Proben auf ein kohlenstofffilmbeschichtetes Kupfergitter, das auf einem Kryohalter montiert ist. Beobachten Sie die Morphologie mit der kryogenen Transmissionselektronenmikroskopie (200 kV, Vergrößerung von 10.000-60.000)14.
- Messen Sie die hydrodynamische Partikelgröße von DNA-kodierten Nanosensoren durch dynamische Lichtstreuung (DLS).
3. Sensorinjektion und Urinsammlung
- Sammeln Sie Urin für die Basismessung.
- Setzen Sie die Maus in eine benutzerdefinierte Gehäusekammer (siehe Ergänzende Abbildung 1) mit einer 96-Well-Platte als Basis.
- Halten Sie die Maus fest und üben Sie sanften Druck auf die Blase aus, um den verbleibenden Urin auf die Platte zu entleeren.
- Pipettieren Sie den gesammelten Urin (~100-200 μl) von der 96-Well-Platte in ein 1,5-ml-Röhrchen, nachdem Sie die Maus in das normale Gehäuse eingesetzt haben.
- Etablierung eines präklinischen murinen Tumormodells.
- Beimpfen Sie 6 bis 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse durch intravenöse Injektion mit Luciferase-exprimierender MC26-Fluc-Zelllinie (100.000 Zellen/Maus) (siehe Materialtabelle). Überwachen Sie die Tumorprogression wöchentlich mit einem In-vivo-Fluoreszenzbildgebungssystem.
HINWEIS: Eine sichtbare Tumorlast, die durch ein Lumineszenzsignal angezeigt wird, tritt ungefähr in Woche 2 der Injektion dieser speziellen Zelllinie auf. Kontrollieren Sie tumortragende Tiere während der Tumorprogression regelmäßig.
- Beimpfen Sie 6 bis 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse durch intravenöse Injektion mit Luciferase-exprimierender MC26-Fluc-Zelllinie (100.000 Zellen/Maus) (siehe Materialtabelle). Überwachen Sie die Tumorprogression wöchentlich mit einem In-vivo-Fluoreszenzbildgebungssystem.
- Injektion von Nanosensoren zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tumorimplantation.
- Bereiten Sie eine Injektionslösung (200 μl maximales Volumen) vor, die Nanosensoren in einer Konzentration von 1 nmol per DNA-Barcode in sterilem PBS enthält.
- Injizieren Sie 200 μl Sensorlösung in PBS intravenös in jede experimentelle Maus.
- Sammeln Sie Urinproben von gesunden Kontroll- und tumortragenden Mäusen 1 h nach der Sensorinjektion, wie in den Schritten 1.1-1.3 beschrieben.
HINWEIS: Frische Urinproben können direkt zur DNA-Barcode-Analyse verarbeitet oder sofort auf Eis eingefroren werden.
4. CRISPR-Detektion von DNA-Barcodes: fluoreszenzbasiert
- Verwenden Sie frische Urinproben oder tauen Sie gefrorene Proben auf Eis auf. Zentrifugieren Sie Urinproben bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Kombinieren Sie die Reagenzien in der ergänzenden Tabelle 2, fügen Sie zuletzt das Cas12a-Enzym (siehe Materialtabelle) hinzu und mischen Sie die Reaktion vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Führen Sie die Reporterreaktion, wie in der ergänzenden Tabelle 3 gezeigt, in dreifacher Ausführung mit dem Produkt aus Schritt 2 aus. Fügen Sie die Reaktion aus Schritt 2 zuletzt hinzu und bringen Sie sie schnell in den Plattenleser.
- Nachweis der LbaCas12a-Aktivierung durch Messung der Fluoreszenz mit einem Plattenlesegerät bei 37 °C alle 2 Minuten für 3 Stunden (λz. B. 485 nm und λem: 535 nm), um die Spaltkinetik des DNA-Reporters zu überwachen.
- Um die fluoreszierenden Messdaten zu analysieren, verwenden Sie das Python-Paket für die Analyse der Enzymkinetik, das unter https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic verfügbar ist. Dieses Skript berechnet die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit (V0) anhand der Steigung der linearen Anpassung der ersten 8-10 Anfangszeitpunkte.
5. CRISPR-Detektion von DNA-Barcodes: papierbasiert
- Zentrifugieren Sie Urinproben bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Führen Sie die Urinproben für die fluoreszenzbasierte und papierbasierte CRISPR-Detektion parallel durch. - Kombinieren Sie die Reagenzien in der ergänzenden Tabelle 2. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
HINWEIS: Dieser Inkubationsschritt ist identisch mit dem für die fluoreszenzbasierte CRISPR-Detektion. - Führen Sie die Reporterreaktion mit einem FAM-Biotin-markierten DNA-Reporter für den Lateral-Flow-Assay auf einem Papierstreifen durch (siehe Materialtabelle). Kombinieren Sie die Reagenzien in der ergänzenden Tabelle 4 in einer 96-Well-Platte mit dem Produkt aus Schritt 2. Mit Alufolie abdecken und 1 h bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Wählen Sie die optimale Inkubationszeit entsprechend der Echtzeit-Kinetiküberwachung im oben beschriebenen fluoreszenzbasierten CRISPR-Detektionsassay. - In eine frische Vertiefung einer 96-Well-Platte 80 μl PBS geben. Geben Sie 20 μl der Probe aus Schritt 3 in diese Vertiefung.
- Legen Sie einen Lateral-Flow-Papierstreifen in jede Vertiefung und warten Sie, bis die Flüssigkeit die Oberseite des Streifens erreicht hat (<5 Minuten). Achten Sie auf das Erscheinungsbild der Kontroll- und/oder Probenbande(n) auf dem Papierstreifen.
- Machen Sie ein Foto des Lateral-Flow-Streifens und quantifizieren Sie die Bandenintensität mit ImageJ.
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Representative Results
Nominierung von Protease-aktivierten Peptidsubstraten
Um Sensoren zu entwerfen, die Veränderungen in der proteolytischen Aktivität des Gewebes widerspiegeln, wird die Proteaseaktivität im Gewebe zunächst mit einer Bibliothek von Peptidsonden13 charakterisiert (Abbildung 1). Frische und gefrorene Gewebeproben können wesentliche Informationen über die proteolytische Aktivität der Tumormikroumgebung liefern, indem Gewebeproben mit FRET-Sonden kombiniert werden, die zur Erkennung der Substratspaltung entwickelt wurden. Eine Bibliothek von FRET-Sonden mit einem FAM-Fluorophor und einem CPQ-2-Quencher wird mit Gewebeproben inkubiert. Sonden mit dem größten Unterschied in der Spaltungsrate zwischen Scheingewebe und Tumorgewebe, gemessen durch Fluoreszenzspektrophotometrie, werden als Peptidlinker für den Einsatz in den In-vivo-Nanosensoren ausgewählt (Abbildung 1A). Um die Physiologie der Tumorumgebung besser zu verstehen und Protease-Expressionsprofile effektiv mit Aktivitätsprofilen zu vergleichen, können die FRET-Sonden mit rekombinanten Proteasen inkubiert werden, um die Substratspaltung mit der spezifischen Proteaseaktivität in Verbindung zu bringen, wie mit zwei Beispielsonden in Abbildung 1B gezeigt.
Sensorformulierung und -charakterisierung
Die Nanosensoren bestehen aus einem polymeren Kern, Peptiden und einzelsträngigen DNA-Barcodes, wie in Abbildung 2A dargestellt. Die polymeren Kerne sind 40 kDa, PEG-Dendrimere, die als Träger für bis zu 8 Peptid-DNA-Konjugate fungieren (Abbildung 2B). Die Peptide, ~1,4 kDa, verbinden den Kern und die DNA mit einer Aminosäuresequenz, die durch proteolytische Aktivität gespalten werden soll. Der einzelsträngige DNA-Barcode ist 20 Basenpaare lang, ~6,8 kDa, und chemisch modifiziert, um die Stabilität in vivo zu verbessern. Nach der Konjugation wird das Peptid-DNA-Konstrukt mittels HPLC aufgereinigt, was eine Trennung der konjugierten und freien Bestandteile ermöglicht (Abbildung 2C). Die massenspektrometrische Analyse zeigt, dass das Konjugat ein Molekulargewicht von 8,283 kDa hat, was angesichts der Molekulargewichte der Bestandteile für den Peptid- und DNA-Barcode von 1,4 kDa bzw. 6,8 kDa zu erwarten ist. Das Peptid-DNA-Konjugat wird weiter an das PEG-Dendrimer konjugiert. Der resultierende Sensor wird mit FPLC aufgereinigt, um freie Peptid-DNA zu entfernen, die im Vergleich zu den PEGylierten eine längere Retentionszeit aufweist (Abbildung 2D). Die Größe des Sensors kann durch dynamische Lichtstreuung und kryogene Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert werden, die auf eine Durchmesserzunahme nach Peptid-DNA-Zugabe zum Kern von ~8 nm auf ~20 nm hinweisen (Abbildung 2B). Die Varianz in der Partikelgröße kann auf die Flexibilität der konstituierenden Ketten und eine variable Anzahl von Peptid-DNA-Armen zurückzuführen sein, die an jedes PEG-Dendrimer konjugiert sind.
Präklinisches Modell für murine Erkrankungen
Die In-vivo-Arbeit zum Testen der Sensoren umfasst die Etablierung von Tumoren in der Lunge von BALB/c-Mäusen für 3 Wochen, die Injektion der Nanosensoren und das Sammeln von Urin 1 h nach der Sensorinjektion (Abbildung 3A). Vor der Tumorinokulation wird auch eine Urinprobe entnommen, um sie mit den Proben nach der Krankheitseinleitung zu vergleichen. Um die Wirksamkeit des Sensors bei der Erkennung von Malignomen zu beurteilen, wird die Luziferase-Expression der Darmkrebszelllinie MC26 (MC26-Fluc) intravenös injiziert, was zu Lungentumorknoten führt, die in der In-vivo-Lumineszenzbildgebung sichtbar sind. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung13 zeigt die Histopathologie des Lungengewebes von tumortragenden bzw. Scheinkontrollmäusen und Hinweise auf die Tumorbildung 11 und 21 Tage nach der Injektion, wie durch schwarze Pfeile in Abbildung 3B angezeigt.
CRISPR-Aktivierung durch chemisch stabilisierte DNA
Um die Cas12a-Aktivierung über ssDNA-Barcodes und komplementäre crRNA-Paarungen zu optimieren, wurden verschiedene Oligonukleotidsequenzen und -längen getestet. Die Aktivierung von Cas12a wird durch Messung des Anstiegs der Fluoreszenz im Laufe der Zeit aufgrund der Cas12a-Spaltung des umstehenden DNA-Reporters mit einer FRET-Paarung bewertet. Eine Erhöhung der Spaltungsrate ist mit höheren Konzentrationen von chemisch modifiziertem ssDNA-Barcode verbunden, wie mit einem repräsentativen crRNA/Barcode-Paar dargestellt (Abbildung 4B). Wichtig ist, dass eine lineare Beziehung zwischen Konzentration und Aktivierung, wie in Abbildung 4B dargestellt, es ermöglicht, das Vorhandensein von DNA-Barcodes im Urin und indirekt die proteolytische Aktivität in vivo widerzuspiegeln. Darüber hinaus können mehrere verschiedene crRNA-Sequenzen, wie in der ergänzenden Tabelle 1 beschrieben, für die Cas12a-Aktivierung verwendet werden, was für die Ermöglichung des Multiplexings entscheidend ist. DNA-Aktivatoren wurden für den Bau von In-vivo-Sensoren aufgrund ihrer Ähnlichkeit in der Assay-Leistung ausgewählt. Die chemisch modifizierte ssDNA, die für die In-vivo-Stabilität des synthetischen Biomarkers entscheidend ist, zeigte im Vergleich zu unmodifizierter dsDNA und ssDNA eine Cas12a-Aktivierung (Abbildung 4C).
Multiplex-Urindetektion von chemisch stabilisierten DNA-Barcodes
Mehrere crRNA-modifizierte einzelsträngige DNA-Aktivatorpaare (ssDNA) wurden auf ihre Orthogonalität zwischen verschiedenen Sequenzen überprüft. Dies ermöglicht das gleichzeitige Auslesen in mehreren Well-Assays, wie in Abbildung 5A dargestellt. Darüber hinaus können modifizierte DNA-Moleküle in unverarbeitetem Urin mit einer kolorimetrischen Anzeige auf Lateral-Flow-Papierstreifen nachgewiesen werden, wie in Abbildung 5B gezeigt. Das Vorhandensein der führenden "Probenbande" zeigt die Freisetzung von nachweisbarem FAM durch die Spaltung des Reporters an, nachdem Cas12a durch die DNA des Urins ausgelöst wurde. Wenn Cas12a durch den DNA-Aktivator im Mausurin aktiviert wird, spaltet es den Fluorescein (FAM)-Biotin-gepaarten Oligonukleotid-Reporter und setzt das FAM-Molekül frei, das dann auf der "Probenbande" nachweisbar ist. Ungespaltene Reporter werden aufgrund der Bindung von Biotin an Streptavidin in der "Kontrollbande" erfasst. Nanosensoren werden für In-vivo-Experimente ausgewählt und unter Verwendung von Protease-aktivierbaren Peptiden und unterschiedlichen DNA-Barcodes konstruiert. Peptide werden durch Ex-vivo-Gewebeprofilierung nominiert (Abbildung 1A) und DNA-Barcodes werden basierend auf einer ähnlichen Cas12a-Aktivierung ausgewählt (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Identifizierung von Peptidsubstraten, die durch fehlregulierte Proteasen bei Darmkrebs für den Sensoraufbau aktiviert werden. (A) FRET-gepaarte Peptidsubstrate, die jeweils aus einer Peptidsequenz bestehen, die von einem FAM-Fluorophor und einem CPQ-2-Quencher flankiert wird, werden gegen rekombinante proteolytische Enzyme oder Gewebehomogenate gescreent. (B) Repräsentative Protease-Spaltkinetik von FRET-gepaarten Peptidsubstraten (Sonde 1 & 2). Die Abbildung ist eine Adaption von Hao et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung eines DNA-barcodierten aktivitätsbasierten Nanosensors mit einem polymeren PEG-Kern. (A) DNA-barcodierte Nanosensoren bestehen aus polymeren Nanocarriern (8-armigem PEG), die mit Protease-aktivierten Peptiden funktionalisiert sind, die mit Oligonukleotiden barcodiert sind. (B) Die dynamische Lichtstreuungsanalyse zeigt eine Zunahme der Partikelgröße von 8,3 nm (nur PEG-Kern) und 13 nm (funktionalisierter Sensor). (C) HPLC-Aufreinigung von Peptid-DNA-Konjugat. Das Konjugat wird in der Massenspektrometrie analysiert und zeigt das erwartete Molekulargewicht. (D) Die FPLC-Aufreinigung des Sensors zeigt die Trennung von funktionalisiertem Sensor und ungebundenem Peptid-DNA-Konjugat. Die Abbildung ist eine Adaption von Hao et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: In-vivo-Krankheitsinduktion und Sensornutzung. (A) Zeitleiste der longitudinalen Tumorüberwachung mit Nanosensor zu verschiedenen Zeitpunkten während der Tumorentwicklung. (B) Histologische Lungenfärbung von BALB/c-Mäusen mit CRC-Lungentumoren 11 und 21 Tage nach der Tumorinokulation und mit Kochsalzlösung injizierten Sham-Kontrollmäusen. Maßstabsleiste = 200 μm. Die Organe wurden fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Studie wurde mit n = 3 Mäusen pro Zeitpunkt durchgeführt und es werden Bilder von einem repräsentativen Tier gezeigt. Pfeile zeigen Tumorknoten in der Lunge an. Die Abbildung ist eine Adaption von Hao et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Cas12a-Aktivierung durch chemisch stabilisierte DNA-Aktivatoren. (A) Die Aktivierung von Cas12a durch einen repräsentativen ssDNA-Barcode durch Bindung an komplementäre crRNA führt zu einer dosisabhängigen Transspaltung der Bystander-DNA, gemessen durch die Fluoreszenzintensität mittels Spektralphotometer. (B) Die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit (V0) wird aus der Steigung der Kurve zu Beginn einer Reaktion in (A) bestimmt und aufgetragen, um den linearen Bereich der Assay-Leistung zu bestimmen. (C) Cas12a-Aktivierung durch doppelsträngige, einzelsträngige und chemisch modifizierte DNA-Aktivatoren. Die Abbildung ist eine Adaption von Hao et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Multiplex-CRISPR-Cas12-vermitteltes DNA-Barcode-Auslesen mit zwei Detektionsoptionen. (A) Trans-Spaltungsraten von Cas12a bei Aktivierung verschiedener modifizierter ssDNA-Aktivator-crRNA-Paare werden im Cas12a-Fluoreszenzspaltungsassay bestimmt. Die Assays werden mit Urinproben von Mäusen durchgeführt, denen nach 1 h intravenöser Verabreichung 1 nmol modifizierter ssDNA-Aktivator injiziert wurde. Die Abbildung ist eine Adaption von Hao et al.13. (B) Die Papieranzeige von Urinproben-aktiviertem Cas12a mit farbmetrischen Änderungen erscheint an verschiedenen Stellen des Papierstreifens. Die obere Bande stammt von gespaltenem FAM-DNA-Reporter und die untere Bande von ungespaltenem FAM-Biotin-Reporter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Urinsammelkammer über einer 96-Well-Platte. Die Maus wird vorübergehend in den Zylinder gelegt, um in die 96-Well-Platte zu urinieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Oligo- und Peptidsequenzen für die Sensorformulierung und den CRISPR-Assay. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Reagenzien für fluoreszenzbasierte und papierbasierte Cas12a- und Urinprobenreaktionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Reagenzien der Reporterreaktion für die fluoreszenzbasierte CRISPR-Detektion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 4: Reagenzien der Reporterreaktion für den papierbasierten CRISPR-Nachweis. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird eine hochgradig anpassbare Plattform für die Multiplex-Krebserkennung mit einem tragbaren Urintest vorgestellt, der die krankheitsassoziierte proteolytische Aktivität mit einem minimalinvasiv injizierten Sensor bewertet. Bei Aktivierung durch Tumorproteasen wird die Peptidsubstratspaltung durch DNA-Barcode-Freisetzung in den Urin amplifiziert. Die synthetischen DNA-Reporter in einer Urinprobe können durch eine sekundäre CRISPR-Cas-vermittelte enzymatische Amplifikation mittels fluorometrischer Detektion oder eines einfachen papierbasierten Tests ausgelesen werden. DNA-Barcoding ist eine attraktive Methode zur Kennzeichnung synthetischer Biomarker, um Multiplexität zu ermöglichen. Die Verbesserung der Stabilität der DNA-Barcodes durch chemische Modifikation ist unerlässlich, um die Stabilität der Nanosensoren in vivo aufrechtzuerhalten. Insbesondere kann die DNA-Barcode-Detektion über CRISPR-Cas12a mit vollständig phosphorthioatmodifizierten DNA-Barcodes mit einem stabilisierten Rückgrat aktiviert werden. Die chemische Modifikation verringert jedoch die Geschwindigkeit der Aktivierung von CRISPR-Cas12a im Vergleich zu seinem nativen DNA-Gegenstück aufgrund seiner erhöhten Stabilität. Darüber hinaus kann das Einfügen terminaler Modifikationen in die crRNA oder das Testen verschiedener modifizierter Oligonukleotide in den DNA-Barcodes die Empfindlichkeit des CRISPR-vermittelten DNA-Barcode-Nachweises15 weiter erhöhen und dadurch die Nachweisgrenze (LOD) der Krebsdiagnostik verbessern.
Neben der molekularen Amplifikation besteht eine weitere wichtige Strategie zur Erreichung der für die Krebsfrüherkennung erforderlichen LOD darin, die Größenfiltration durch die Nieren zu nutzen, um die synthetischen DNA-Reporter im Urin zu konzentrieren. Zu diesem Zweck ist es entscheidend, die Größe der DNA-Barcodes zu optimieren. 20-mer-crRNA-komplementäre DNAs zeigten eine optimale CRISPR-Cas12a-vermittelte DNA-Barcode-Auslesung aus den Urinproben. Diese optimale Länge kann sich unterscheiden, wenn sie auf verschiedene CRISPR-Nukleasen oder präklinische Tiermodelle angewendet wird.
Um die Reproduzierbarkeit dieses Detektionssystems zu erhalten, ist es wichtig, eine gründliche Charakterisierung der injizierbaren Nanosensoren durchzuführen, um die Variation von Charge zu Charge zu minimieren. Variationen in der Anzahl der Peptid-DNA-Konjugate pro Kern verändern die Menge der DNA-Barcodes, die in den Urin freigesetzt werden, und beeinflussen daher die endgültige Auslesung. Ebenso trägt eine sorgfältige intravenöse Injektion des Sensors zur Konsistenz der Sensordosierung bei. Um eine angemessene Urinsammlung von mindestens 50 μl Urinvolumen von jedem Tier zu einem bestimmten Zeitpunkt zu gewährleisten, ist die Aufrechterhaltung der tumortragenden Flüssigkeitszufuhr von Tieren von entscheidender Bedeutung. Dies kann unterstützt werden, indem die Mäuse eine Stunde vor der Urinsammlung auf nicht benetzendem Wassergel gehalten oder PBS subkutan injiziertwerden 16.
Der Zeitpunkt der Urinsammlung und die Dauer der CRISPR-Cas-vermittelten DNA-Barcode-Auslesung sind entscheidende Faktoren für die Konsistenz des Assays. Im Umlauf befindliche Barcodes durchlaufen nach intravenöser Injektion und größenabhängiger Nierenfiltration aus dem Blut einen charakteristischen einfachen exponentiellen Konzentrationsabfall, der 1 h nach der Verabreichung in Mausmodellen seinen Höhepunkt erreicht13. Dieser Zeitpunkt kann in einem anderen Tiermodell variieren. Für die beiden Ausleseformate von CRISPR-Cas-Aktivierungsassays (fluoreszierender vs. papierbasierter Lateral-Flow-Assay) ist es wichtig, die fluoreszenzbasierte Kinetik vor dem Lateral-Flow zu verfolgen, um den optimalen Endpunkt zum Ablesen des CRISPR-Cas-Spaltprodukts zu ermöglichen.
Dieser Ansatz ist vorteilhaft aufgrund der Einbeziehung von dualen Signalverstärkungsschritten aus proteolytischer und CRISPR-Cas-vermittelter enzymatischer Aktivierung und der Multiplexing-Fähigkeit, die Komplexität von Krankheiten zu erfassen. Die Erweiterung der Multiplexität der Sensoren erfordert eine sorgfältige Materialdosierung sowie eine Erhöhung des Durchsatzes der Auslesung, um die Portabilität und Benutzerfreundlichkeit zu erhalten. Diese Strategie erfordert eine gründliche Charakterisierung der Proteaseaktivität in mehreren Modellen und der Spezifität des proteolytischen Profils für eine bestimmte Krankheit oder ein bestimmtes Krankheitsstadium. Während die Sensorinjektion weniger invasiv ist als viele der diagnostischen Alternativen wie die Biopsie, kann sich die intravenöse Injektion für die Sensorverabreichung auf ausgebildete Phlebotomisten verlassen, was den Anwendungsfall möglicherweise auf die Krankheitsüberwachung und nicht auf die Ersterkennung in einem klinischen Umfeld beschränkt. Zusätzlich zur systemischen Injektion können die DNA-Barcode-Nanosensoren mit Formulierungen weiterentwickelt werden, die durch nichtinvasive orale, inhalative und topische Verabreichung appliziert werden können, um eine tragbare Krankheitserkennung und eine einfache Selbstüberwachung des Krankheitsverlaufs und der Therapiebewertung zu ermöglichen.
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Disclosures
S.N.B., L.H. und R.T.Z. sind als Erfinder in einer Patentanmeldung aufgeführt, die sich auf den Inhalt dieses Werks bezieht. S.N.B. hält Anteile an Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio und ist Direktor bei Vertex; berät Moderna und erhält gesponserte Forschungsgelder von Johnson & Johnson, Revitopen und Owlstone.
Acknowledgments
Diese Studie wurde teilweise durch einen Koch Institute Support Grant Nummer P30-CA14051 des National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), einen Core Center Grant P30-ES002109 des National Institute of Environmental Health Sciences, das Marble Center for Cancer Nanomedicine des Koch-Instituts, das Koch Institute Frontier Research Program über den Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund unterstützt. und der Virginia and D. K. Ludwig Fund for Cancer Research. A.E.V.H. wird durch ein NIH-finanziertes Predoctoral Training Fellowship (T32GM130546) unterstützt. S.N.B. ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. L.H. wird durch einen K99/R00 Pathway to Independence Award des National Cancer Institute und die Startfinanzierung der Boston University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
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