Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

CRISPR-Cas-mediert multianalytt syntetisk urinbiomarkørtest for bærbar diagnostikk

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/66189
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 3,4, 2,3,4,5,6,7,8, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Howard Hughes Medical Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard, 6Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 8Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School

Summary

Denne protokollen beskriver en CRISPR-Cas-mediert, multianalytt syntetisk urinbiomarkørtest som muliggjør pasientnær kreftdiagnostikk gjennom ex vivo-analyse av tumorassosierte proteaseaktiviteter.

Abstract

Å skape syntetiske biomarkører for utvikling av presisjonsdiagnostikk har gjort det mulig å oppdage sykdom gjennom veier utover de som brukes til tradisjonelle biofluidmålinger. Syntetiske biomarkører bruker generelt reportere som gir lesbare signaler i biofluidet for å gjenspeile de biokjemiske endringene i det lokale sykdomsmikromiljøet under sykdomsforekomst og progresjon. Den farmakokinetiske konsentrasjonen av reporterne og biokjemisk forsterkning av sykdomssignalet er avgjørende for å oppnå høy sensitivitet og spesifisitet i en diagnostisk test. Her er en kreftdiagnostisk plattform bygget ved hjelp av ett format av syntetiske biomarkører: aktivitetsbaserte nanosensorer som bærer kjemisk stabiliserte DNA-reportere som kan frigjøres av avvikende proteolytiske signaturer i tumormikromiljøet. Syntetisk DNA som sykdomsreporter gir multipleksingsevne gjennom bruk som strekkode, noe som muliggjør avlesning av flere proteolytiske signaturer samtidig. DNA-reportere som slippes ut i urinen, detekteres ved hjelp av CRISPR-nukleaser via hybridisering med CRISPR-RNA, som igjen produserer et fluorescerende eller kolorimetrisk signal ved enzymaktivering. I denne protokollen konstrueres DNA-strekkodede, aktivitetsbaserte nanosensorer, og deres anvendelse er eksemplifisert i en preklinisk musemodell av metastatisk kolorektal kreft. Dette systemet er svært modifiserbart i henhold til sykdomsbiologi og genererer flere sykdomssignaler samtidig, noe som gir en omfattende forståelse av sykdomsegenskapene gjennom en minimalt invasiv prosess som bare krever nanosensoradministrasjon, urininnsamling og en papirtest som muliggjør pasientnær diagnostikk.

Introduction

Til tross for den betydelige innsatsen for å identifisere tumorbiomarkører som skurproteiner og DNA, har kreftdiagnosefeltet blitt anstrengt av deres lave overflod eller raske nedbrytning i sirkulasjon1. Som en komplementær strategi representerer biokonstruerte syntetiske biomarkører som selektivt reagerer på sykdomsegenskaper for å generere forsterkede signaler, nye veier mot nøyaktig og tilgjengelig diagnostikk 2,3. For å hjelpe deteksjon, utnytter disse syntetiske biomarkørene tumoravhengige aktiveringsmekanismer som enzymatisk amplifisering for å produsere analytter med forbedret signal-støyforhold4. Her utnyttes en klasse kreftassosierte enzymer, proteaser, for å aktivere injiserbare nanoskalasensorer for å frigjøre sykdomsreportere som kan påvises fra biofluidene som blod eller urin 5,6. I lys av tumorheterogenitet tillater utvikling av et panel av proteaseaktiverte sensorer multianalytttester som kombinerer forskjellige protease-spaltningshendelser til en "sykdomssignatur" for å vurdere kreftforekomst og progresjon på en mer spesifikk, multiplekset måte.

Proteaseaktiverte syntetiske biomarkører er utviklet som omfatter peptidsubstrater konjugert til overflaten av en inert bærer7. Når de injiseres in vivo, blir disse peptidene ført til svulsten, hvorpå enzymatisk spaltning av tumorproteaser frigjør reportere i blod eller urin for påvisning. Multiplekset deteksjon med proteaseaktiverte syntetiske biomarkører krever at hver syntetisk biomarkør i en cocktail skal merkes med en unik molekylær strekkode. For dette formål har ulike tilnærminger blitt utviklet, inkludert masse strekkoder og ligandkodede reportere 8,9,10. I motsetning til disse metodene for multipleksing som kan være begrenset til noen få forskjellige signalmuligheter, gir DNA-strekkoding mange flere kombinasjoner i samsvar med den høye kompleksiteten og heterogeniteten til menneskelige sykdomstilstander. For å utvide mangfoldet av syntetiske biomarkører, er sensorene strekkodet ved å merke hver reporter med en unik DNA-sekvens for deteksjon via CRISPR-Cas-nuklease for å forsterke det biofluidiske signalet ex vivo. Disse enkeltstrengede DNA-strekkodene (ssDNA) er designet for å binde seg til komplementære CRISPR-guide-RNA (crRNAer), og aktiverer den målutløste sikkerhetsnukleaseaktiviteten til CRISPR-Cas12a11. Denne nukleaseaktiviteten kan brukes til å spalte en reporter-DNA-streng oppdaget gjennom fluorescenskinetikk eller ved bruk av papirstrimler.

I tillegg til molekylær forsterkning via proteaser (in vivo) og CRISPR-Cas (ex vivo), innebærer et annet viktig designtrekk ved proteaseaktiverte syntetiske biomarkører å utnytte nanomaterialets farmakokinetikk for å øke diagnostisk signalkonsentrasjon i biofluider10. En tilnærming er bruken av en nanopartikkelbærer for å øke sirkulasjonstiden til overflatekonjugerte peptidsubstrater. En polyetylenglykol (PEG) dendrimer er valgt som en nanobærer med relativt liten hydrodynamisk diameter og multivalens for å øke levering til svulster. Selv om den er liten nok til å fremme tumorlevering, er størrelsen på PEG-bæreren større enn ~ 5 nm størrelsesavskjæringen av nyrens glomerulære filtreringsbarriere, slik at bare spaltede peptidsubstrater kan ryddes i urinen, og utnytter størrelsesfiltrering av nyrene12. I denne protokollen er flertrinnsarbeidsflyten skissert for syntese og anvendelse av DNA-strekkodede aktivitetsbaserte nanosensorer i en preklinisk murinmodell, og fremhever oppsettet av CRISPR-Cas-mediert, multianalytt syntetisk urinbiomarkørtest, som har blitt brukt av denne gruppen for å klassifisere sykdomsstatus i murine modeller av flere krefttyper13. På grunn av det allsidige designprinsippet kan alle tre funksjonelle komponenter i nanosensoren - nanobæreren (PEG-polymeren), den stimuli-responsive modulen (proteaseaktivert substrat) og den biofluidiske reporteren (DNA-strekkode) - byttes nøyaktig i henhold til applikasjonsspesifikke behov, noe som muliggjør modularitet ved å skreddersy mål- og utgivelsesspesifisiteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved forfatterinstitusjonen. Standard dyrepleiefasiliteter, inkludert boligkamre, sterile hetter, bedøving og etisk endepunkteuthanisering er nødvendig for å utføre disse forsøkene på riktig måte. Alle forsøk utføres i tråd med institusjonelle og nasjonale retningslinjer og overvåkes av veterinærpersonalet ved institusjonen. Kvinnelige BALB / c-mus, som ble brukt til forsøkene, er hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell) og varierte i alder fra 6 til 8 uker ved starten av studien. Sekvenser for spesialsyntetisert DNA, crRNA, FRET-baserte peptidsubstratprober og sensorpeptider er gitt i tilleggstabell 1.

1. Protease-aktivert peptidsubstratvalg

  1. Samle inn og forberede vevsprøver fra friskt lunge- eller lungevev med svulstknuter etter en tidligere publisert rapport13.
    1. Homogeniser vev i forkjølt fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) (200 mg vev / ml PBS) med vevsdissosiasjonsrør for automatisert dissosiasjon av vev til encellede suspensjoner.
    2. Sentrifugevevshomogenater ved 6000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Behold supernatanten i en ny tube.
    3. Sentrifuger supernatanten ved 14 000 x g i 25 minutter ved 4 °C.
    4. Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA) protein assay kit (se tabell over materialer).
    5. Tilsett PBS i prøven for å fremstille en 0,33 mg/ml oppløsning.
  2. Vurder den proteolytiske aktiviteten ved å følge trinnene nedenfor.
    1. I en 384-brønnplate, tilsett 5 μL, 6 μM FRET-baserte peptidsubstratprober til hver brønn. For hver sonde, utfør reaksjonen i tre eksemplarer.
      MERK: FRET-basert peptidsubstratsonde inneholder en kort peptidsekvens (6-8 aminosyrer, designet for å være spesifikk for en målprotease eller gruppe proteaser) avsluttet med en fluorofor og slukkerpar. Som eksempel er to FRET-sonder beskrevet i tilleggstabell 1 . Det komplette biblioteket av sonder finnes i Hao et al.13.
    2. Sentrifuger brønnplaten i 10 s ved romtemperatur ved 180 x g for å sikre at sondene er i bunnen av platen.
    3. Tilsett 25 μL 0,33 mg/ml vevsprøve eller 40 μM rekombinantprotease 13 til hver brønn.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av vevsprøven eller rekombinant protease må kanskje optimaliseres i henhold til deres iboende proteolytiske aktivitet. For eksempel kan svært proteolytisk vev som tarmene kreve høyere fortynningsfaktorer for å muliggjøre overvåking av innledende enzymatisk spaltning.
    4. Sentrifuger brønnplaten kort ved 180 x g (ved romtemperatur) for å blande sonder og vevslysater.
    5. Begynn umiddelbart å oppdage sondespalting ved å måle fluorescens med plateleseren ved 37 °C hvert 2. minutt i 1 time (λeks: 485 nm; λem: 535 nm) for å overvåke spaltningen.
      MERK: Bruk passende eksitasjons- og emisjonsbølgelengder for spesifikke fluorofor- og slukkerpar. I tilfelle av denne studien er parametere (λeks: 485 nm og λem: 535 nm) satt for FAM-fluoroforen.
    6. For å analysere fluorescerende måledata, bruk Python-pakken (se materialtabell) for enzymkinetikkanalyse tilgjengelig på https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dette skriptet beregner den opprinnelige reaksjonshastigheten (V0) ved hjelp av hellingen til den lineære tilpasningen til de første 8-10 innledende tidspunktene.

2. Sensorformulering og karakterisering

  1. Syntetisere konjugatet av DNA og proteaseaktivert peptid (PAP).
    1. Inkuber 20-mer fosforothioerte DNA-reportere med 3'-DBCO-gruppe (1.1 eq., se materialtabell) med azid-terminerte PAPs med C-terminus cysteinende i 100 mM fosfatbuffer (pH 7,0) ved romtemperatur i >4 timer. Hvis du drar over natten, ruges ved 4 °C.
    2. Rens produktet på et høyytelses væskekromatografisystem (HPLC) utstyrt med en kolonne som er ideell for biomolekyler (se materialtabell). Sett HPLC-gradienten til å starte fra 5% A-buffer (0,05% TFA i H2O), hold isokratisk i 20 minutter og nå 80% B-buffer (0,05% TFA, 99,95% acetonitril) ved 65 minutter med en strømningshastighet på 0,3 ml min-1, og samle konjugatproduktet med retensjonstid på ~ 31 min.
    3. Validere de rensede konjugatene ved matriseassistert laserdesorpsjon / ioniseringstid for flyging (MALDI-TOF) massespektrometri ved bruk av α-cyano-4-hydroksykinnaminsyre som matrise14 (se materialtabell).
  2. Syntetisere DNA-kodede aktivitetsbaserte nanosensorer.
    1. Løs opp 2 mg multivalent PEG (40 kDa, 8-arm, se materialfortegnelse) med maleimidreaktiv gruppe i 1 ml 100 mM fosfatbuffer (pH 7,0) og filter (grenseverdi: 0,2 μm).
    2. Tilsett cystein-terminerte DNA-peptidkonjugater (2 eq., se materialtabell) til PEG og reager ved romtemperatur i >4 timer. Hvis du drar over natten, ruges ved 4 °C.
    3. Fjern de ukonjugerte materialene ved hjelp av størrelsesekskluderingskromatografi med en kommersielt tilgjengelig dekstran-agarose komposittmatrisekolonne på en rask proteinvæskekromatografi (FPLC) (se materialfortegnelse). Kjør prøver i PBS og overvåk absorbans ved 260 nm for DNA og 280 nm for peptid.
    4. Konsentrer de syntetiserte nanosensorene med sentrifugalfilterrør (MWCO = 10 kDa) i henhold til produsentens anbefalte hastighet (se materialtabell).
    5. Kvantifiser konsentrasjonen av DNA ved hjelp av ssDNA-analysesett (se materialtabell) og en plateleser ved λeks: 485 nm og λem: 535 nm. Oppbevar nanosensorene ved 4 °C.
  3. Karakterisere DNA-kodede aktivitetsbaserte nanosensorer.
    1. Mål den hydrodynamiske partikkelstørrelsen til DNA-kodede nanosensorer ved dynamisk lysspredning (DLS).
      MERK: Det forventede størrelsesområdet for nanosensorer er 15-50 nm, med en gjennomsnittlig størrelse på 20-30 nm. Hvis et begrenset størrelsesområde er ønskelig, kan FPLC (i trinn 2.3) brukes til å isolere smalere fraksjoner med forskjellige molekylvekter.
    2. Konsentrer nanosensorene til 0,5 mg / ml (ved DNA-konsentrasjon) med sentrifugalfilterrør (MWCO = 10 kDa) og last prøvene på et karbonfilmbelagt kobbergitter montert på en kryoholder. Observer morfologien ved hjelp av kryogen transmisjonselektronmikroskopi (200 kV, forstørrelse på 10 000-60 000)14.

3. Sensorinjeksjon og urinoppsamling

  1. Samle urin for baseline måling.
    1. Plasser musen i et tilpasset huskammer (se tilleggsfigur 1) med en 96-brønnsplate som base.
    2. Hold musen tilbake og trykk forsiktig på blæren for å tømme gjenværende urin på platen.
    3. Pipetter den oppsamlede urinen (~ 100-200 μL) fra 96-brønnplaten til et 1,5 ml rør etter å ha erstattet musen til det normale huset.
  2. Etablere preklinisk murine tumormodell.
    1. Inokuler 6 til 8 uker gamle BALB / c kvinnelige mus ved intravenøs injeksjon med luciferase-uttrykkende MC26-Fluc cellelinje (100k celler / mus) (se materialtabellen). Overvåk tumorprogresjon ukentlig ved hjelp av et in vivo fluorescensavbildningssystem.
      MERK: Synlig tumorbelastning indikert ved luminescerende signal oppstår omtrent i uke 2 etter injeksjon av denne bestemte cellelinjen. Kontroller nøye på tumorbærende dyr under tumorprogresjonen med jevne mellomrom.
  3. Injiser nanosensorer på forskjellige tidspunkter etter tumorimplantasjon.
    1. Forbered en injeksjonsoppløsning (maksimalt volum på 200 μL) som inneholder nanosensorer i en konsentrasjon på 1 nmol ved DNA-strekkode i steril PBS.
    2. Injiser 200 μL sensoroppløsning i PBS i hver eksperimentelle mus intravenøst.
  4. Samle urinprøver fra friske kontroll- og tumorbærende mus 1 time etter sensorinjeksjon som beskrevet i trinn 1.1-1.3.
    MERK: Ferske urinprøver kan behandles til DNA-strekkodeanalyse direkte eller fryses umiddelbart på is.

4. CRISPR-deteksjon av DNA-strekkoder: fluorescensbasert

  1. Bruk ferske urinprøver eller tin frosne prøver på is. Sentrifuge urinprøver ved 800 x g i 5 min ved romtemperatur.
  2. Kombiner reagensene i tilleggstabell 2, tilsett Cas12a-enzymet (se materialfortegnelsen) sist og bland reaksjonen forsiktig ved å pipettere opp og ned. Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 30 minutter.
  3. Kjør rapporteringsreaksjonen, som vist i tilleggstabell 3, i tre eksemplarer ved bruk av produktet fra trinn 2. Legg til reaksjonen fra trinn 2 sist og ta den raskt med til plateleseren.
  4. Oppdag LbaCas12a-aktivering ved å måle fluorescens med en plateleser ved 37 °C hvert 2. minutt i 3 timer (λeks: 485 nm og λem: 535 nm) for å overvåke spaltningskinetikken til DNA-reporteren.
  5. For å analysere fluorescerende måledata, bruk Python-pakken for enzymkinetikkanalyse tilgjengelig på https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dette skriptet beregner den opprinnelige reaksjonshastigheten (V0) ved hjelp av hellingen til den lineære tilpasningen til de første 8-10 innledende tidspunktene.

5. CRISPR-deteksjon av DNA-strekkoder: papirbasert

  1. Sentrifuge urinprøver ved 800 x g i 5 min ved romtemperatur.
    MERK: Kjør urinprøvene for fluorescensbasert og papirbasert CRISPR-deteksjon parallelt.
  2. Kombiner reagensene i tilleggstabell 2. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    MERK: Dette inkubasjonstrinnet er identisk med det for fluorescensbasert CRISPR-deteksjon.
  3. Kjør reporterreaksjonen ved hjelp av FAM-biotinmerket DNA-reporter for lateral strømningsanalyse på en papirstrimmel (se materialfortegnelse). Kombiner reagensene i tilleggstabell 4 i en 96-brønnsplate ved bruk av produktet fra trinn 2. Dekk til med aluminiumsfolie og inkuber ved 37 °C i 1 time.
    MERK: Velg den optimale inkubasjonstiden i henhold til kinetikkovervåking i sanntid i den fluorescensbaserte CRISPR-deteksjonsanalysen beskrevet ovenfor.
  4. Til en frisk brønn med en 96-brønnplate, tilsett 80 μL PBS. Tilsett 20 μL prøve fra trinn 3 til denne brønnen.
  5. Plasser en sideveis papirstrimmel til hver brønn og vent til væsken når toppen av strimmelen (<5 min). Se etter utseendet til kontroll- og/eller prøvebåndene på papirremsen.
  6. Ta et bilde av den laterale strømningsstripen og kvantifiser båndintensiteten ved hjelp av ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nominering av proteaseaktiverte peptidsubstrater
For å designe sensorer som vil gjenspeile endringer i vevets proteolytiske aktivitet, karakteriseres proteaseaktiviteten i vevet først ved hjelp av et bibliotek av peptidprober13 (figur 1). Ferske og frosne vevsprøver kan gi betydelig informasjon om den proteolytiske aktiviteten til tumormikromiljøet ved å kombinere vevsprøver med FRET-prober designet for å oppdage substratspaltning. Et bibliotek med FRET-sonder med en FAM-fluorofor og en CPQ-2-slukker inkuberes med vevsprøver. Prober med størst forskjell i spaltningshastighet mellom skamvev og tumorvev, målt ved fluorescensspektrofotometri, er valgt som peptidlinkere for bruk i in vivo nanosensorer (figur 1A). For bedre å forstå tumormiljøets fysiologi og effektivt sammenligne proteaseekspresjonsprofiler med aktivitetsprofiler, kan FRET-probene inkuberes med rekombinante proteaser for å assosiere substratspaltning med spesifikk proteaseaktivitet, som demonstrert med to eksempelprober i figur 1B.

Sensorformulering og karakterisering
Nanosensorene består av en polymerkjerne, peptider og enkeltstrengede DNA-strekkoder, som vist i figur 2A. De polymere kjernene er 40 kDa, PEG-dendrimerer som fungerer som bærere for opptil 8 peptid-DNA-konjugater (figur 2B). Peptidene, ~ 1, 4 kDa, forbinder kjernen og DNA med en aminosyresekvens designet for å bli spaltet gjennom proteolytisk aktivitet. Den enkeltstrengede DNA-strekkoden er 20 basepar i lengde, ~ 6,8 kDa, og kjemisk modifisert for forbedret stabilitet in vivo. Etter konjugering renses peptid-DNA-konstruksjonen via HPLC, noe som muliggjør separasjon av de konjugerte og frie bestanddelene (figur 2C). Massespektrometrianalyse indikerer at konjugatet har en molekylvekt på 8,283 kDa, noe som forventes gitt molekylvektene for peptidet og DNA-strekkoden på henholdsvis 1,4 kDa og 6,8 kDa. Peptid-DNA-konjugatet konjugeres videre til PEG-dendriren. Den resulterende sensoren renses ved hjelp av FPLC for å fjerne fritt peptid-DNA som viser en forlenget retensjonstid sammenlignet med PEGylerte (figur 2D). Størrelsen på sensoren kan karakteriseres via dynamisk lysspredning og kryogen transmisjonselektronmikroskopi, som indikerer en økning i diameter etter peptid-DNA-tillegg til kjernen fra ~ 8 nm til ~ 20 nm (figur 2B). Variasjon i partikkelstørrelse kan skyldes fleksibiliteten til bestanddelskjedene og et variabelt antall peptid-DNA-armer konjugert til hver PEG-dendrimer.

Preklinisk modell for murinsykdom
In vivo-arbeid for å teste sensorene innebærer å etablere svulster i 3 uker i lungene til BALB / c-mus, injisere nanosensorene og samle urin 1 time etter sensorinjeksjon (figur 3A). En baseline urinprøve er også tatt før tumorinokulasjon for å sammenligne med prøver etter sykdomsinduksjon. For å vurdere sensorens effektivitet ved påvisning av malignitet, injiseres luciferase-ekspresjon kolorektal kreftcellelinje MC26 (MC26-Fluc) intravenøst, noe som resulterer i lungetumorknuter synlige in vivo luminescensavbildning. Hematoksylin- og eosinfarging13 viser histopatologi i lungevevet fra henholdsvis tumorbærende og narrekontrollmus og tumordannelse ved 11- og 21-dagers etterinjeksjon, indikert med svarte piler i figur 3B.

CRISPR-aktivering av kjemisk stabilisert DNA
For å optimalisere Cas12a-aktivering via ssDNA-strekkoder og komplementær crRNA-parring, har forskjellige oligonukleotidsekvenser og lengder blitt testet. Aktivering av Cas12a vurderes ved å måle økningen i fluorescens over tid på grunn av Cas12a-spaltning av tilskuer-DNA-reporter med FRET-paring. En økning i spaltningshastighet er assosiert med høyere konsentrasjoner av kjemisk modifisert ssDNA-strekkode, som vist med et representativt crRNA / strekkodepar (figur 4B). Det er viktig at et lineært forhold mellom konsentrasjon og aktivering, som vist i figur 4B, gjør at avlesningen reflekterer DNA-strekkodetilstedeværelse i urinen og indirekte reflekterer proteolytisk aktivitet in vivo. Videre kan flere forskjellige crRNA-sekvenser, som beskrevet i tilleggstabell 1, brukes til Cas12a-aktivering, noe som er kritisk for å muliggjøre multipleksing. DNA-aktivatorer er valgt for konstruksjon av in vivo sensorer basert på deres likhet i analyseytelse. Det kjemisk modifiserte ssDNA, som er kritisk for in vivo-stabiliteten til den syntetiske biomarkøren, demonstrerte Cas12a-aktivering sammenlignet med umodifisert dsDNA og ssDNA (figur 4C).

Multiplekset urindeteksjon av kjemisk stabiliserte DNA-strekkoder
Flere crRNA-modifiserte enkeltstrengede DNA (ssDNA) aktivatorpar har blitt verifisert for deres ortogonalitet mellom forskjellige sekvenser. Dette muliggjør samtidig avlesning i flere brønnanalyser, som vist i figur 5A. I tillegg kan modifiserte DNA-molekyler i ubehandlet urin detekteres ved hjelp av en kolorimetrisk avlesning på laterale papirstrimler, som vist i figur 5B. Tilstedeværelsen av det ledende "prøvebåndet" indikerer frigjøring av detekterbar FAM gjennom reporterspaltning etter at Cas12a er utløst av urin-DNA. Når Cas12a aktiveres av DNA-aktivatoren i museurinen, spalter den fluorescein (FAM)-biotin-parret oligonukleotidreporteren, og frigjør FAM-molekylet, som deretter kan påvises på "prøvebåndet". Uncleaved reportere er fanget på "kontrollbåndet" på grunn av binding av biotin til streptavidin. Nanosensorer er valgt for in vivo eksperimenter og konstruert ved hjelp av protease-aktiverbare peptider og distinkte DNA strekkoder. Peptider nomineres ved ex vivo vevsprofilering (figur 1A) og DNA-strekkoder velges basert på tilsvarende Cas12a-aktivering (figur 4B).

Figure 1
Figur 1 Identifisering av peptidsubstrater aktivert av dysregulerte proteaser ved kolorektal kreft for sensorkonstruksjon. (A) FRET-parede peptidsubstrater, hver bestående av en peptidsekvens flankert av en FAM-fluorofor og en CPQ-2-slukker, screenes mot rekombinante proteolytiske enzymer eller vevshomogenater. (B) Representativ proteasespaltningskinetikk for FRET-parede peptidsubstrater (Probe 1 &; 2). Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering av DNA-strekkodet aktivitetsbasert nanosensor med en polymer PEG-kjerne. (A) DNA-strekkodede nanosensorer omfatter polymer nanobærer (8-arm PEG) funksjonalisert med proteaseaktiverte peptider strekkodet med oligonukleotider. (B) Dynamisk lysspredningsanalyse viser en økning i partikkelstørrelse fra 8,3 nm (kun PEG-kjerne) og 13 nm (funksjonalisert sensor). (C) HPLC-rensing av peptid-DNA-konjugat. Konjugatet analyseres i massespektrometri og viser forventet molekylvekt. (D) FPLC-rensing av sensoren viser separasjon av funksjonalisert sensor og ubegrenset peptid-DNA-konjugat. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: In vivo sykdomsinduksjon og sensorutnyttelse. (A) Tidslinje for langsgående tumorovervåking med nanosensor på forskjellige tidspunkter over tumorutvikling. (B) Histologisk lungefarging av BALB / c-mus som bærer CRC-lungetumorer ved 11- og 21-dagers etter tumorinokulering og saltvannsinjiserte Sham-kontrollmus. Skala bar = 200 μm. Organer ble fiksert, innebygd i parafin og farget med hematoksylin og eosin. Studien ble gjort med n = 3 mus per tidspunkt og bilder fra et representativt dyr er vist. Piler indikerer tumorknuter i lungen. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Cas12a-aktivering av kjemisk stabiliserte DNA-aktivatorer. (A) Aktivering av Cas12a ved en representativ ssDNA-strekkode gjennom binding med komplementært crRNA resulterer i transspaltning av tilskuer-DNA på en doseavhengig måte, målt ved fluorescensintensitet via spektrofotometer. (B) Den initiale reaksjonshastigheten (V0) bestemmes fra kurvens helning ved begynnelsen av en reaksjon i (A) og plottes for å bestemme det lineære analyseområdet. (C) Cas12a-aktivering av dobbeltstrengede, enkeltstrengede og kjemisk modifiserte DNA-aktivatorer. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Multiplekset CRISPR-Cas12-mediert DNA-strekkodeavlesning med to deteksjonsalternativer. (A) Transspaltningshastigheter av Cas12a ved aktivering av forskjellige modifiserte ssDNA-aktivator-crRNA-par bestemmes i Cas12a fluorescerende spaltningsanalyse. Analyser utføres med urinprøver samlet fra mus injisert med 1 nmol modifisert ssDNA-aktivator etter 1 time med intravenøs administrasjon. Figuren er tilpasset fra Hao et al.13. (B) Papiravlesning av urinprøveaktivert Cas12a med kolorimetriske endringer vises på forskjellige steder i papirstrimmelen. Det øverste båndet er fra spaltet FAM DNA-reporter og bunnbåndet er fra uncleaved FAM-biotin reporter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Urinoppsamlingskammer som skal plasseres over en plate med 96 brønner. Musen er midlertidig plassert inne i sylinderen for urinering i 96-brønnplaten. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 1: Oligo- og peptidsekvenser for sensorformulering og CRISPR-analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: Reagenser for fluorescensbasert og papirbasert Cas12a og urinprøvereaksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 3: Reagenser av reporterreaksjon for fluorescensbasert CRISPR-deteksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 4: Reagenser av reporterreaksjon for papirbasert CRISPR-deteksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Presentert her er en svært tilpassbar plattform for multiplekset kreftdeteksjon med en bærbar urintest som vurderer sykdomsassosiert proteolytisk aktivitet ved hjelp av en minimalt invasiv injisert sensor. Når det aktiveres av tumorproteaser, forsterkes peptidsubstratspaltning via DNA-strekkodefrigjøring i urinen. De syntetiske DNA-reporterne i en urinprøve kan leses ut ved en sekundær CRISPR-Cas-mediert enzymatisk amplifikasjon ved hjelp av fluorometrisk deteksjon eller en enkel papirbasert test. DNA-strekkoding er en attraktiv metode for merking av syntetiske biomarkører for å ha råd til multipleksitet. Forbedring av stabiliteten til DNA-strekkodene gjennom kjemisk modifikasjon er avgjørende for å opprettholde nanosensorstabilitet in vivo. Spesielt kan DNA-strekkodedeteksjon via CRISPR-Cas12a aktiveres ved hjelp av fullt fosforotioatmodifiserte DNA-strekkoder med stabilisert ryggrad. Den kjemiske modifikasjonen reduserer hastigheten på CRISPR-Cas12a-aktivering i forhold til sin opprinnelige DNA-motpart, men på grunn av økt stabilitet. Videre kan innsetting av terminale modifikasjoner i crRNA eller testing av forskjellige modifiserte oligonukleotider i DNA-strekkodene ytterligere øke følsomheten til den CRISPR-medierte DNA-strekkodedeteksjonen15, og dermed forbedre deteksjonsgrensen (LOD) for kreftdiagnostikk.

I tillegg til molekylær amplifikasjon, innebærer en annen viktig strategi for å oppnå LOD som kreves for tidlig kreftdeteksjon, å utnytte størrelsesfiltrering av nyrene for å konsentrere de syntetiske DNA-reporterne i urinen. For dette formål er det avgjørende å optimalisere størrelsen på DNA-strekkodene. 20-mer crRNA-komplementære DNAer viste optimal CRISPR-Cas12a-mediert DNA-strekkodeavlesning fra urinprøvene. Denne optimale lengden kan variere når den brukes på forskjellige CRISPR-nukleaser eller prekliniske dyremodeller.

For å opprettholde reproduserbarheten til dette deteksjonssystemet, er det viktig å gjennomføre en grundig karakterisering av de injiserbare nanosensorene for å minimere batch-til-batch-variasjon. Variasjon i antall peptid-DNA-konjugater per kjerne vil endre mengden DNA-strekkoder som frigjøres i urinen og dermed påvirke den endelige avlesningen. På samme måte vil forsiktig injeksjon av sensoren intravenøst bidra til konsistens i sensordoseringen. For å sikre riktig urininnsamling av minst 50 μL urinvolum fra hvert dyr på et gitt tidspunkt, er det viktig å opprettholde tumorbærende dyrehydrering. Dette kan støttes ved å holde musene på ikke-fuktende vanngel eller injisere PBS subkutant en time før urininnsamling16.

Tidspunktet for urininnsamlingen og varigheten av CRISPR-Cas-mediert DNA-strekkodeavlesning er kritiske faktorer for analysekonsistens. Strekkoder i omløp gjennomgår karakteristisk enkelteksponentiell konsentrasjonsforfall etter intravenøs injeksjon og størrelsesavhengig nyrefiltrering fra blodet, med en topp 1 time etter administrering i musemodeller13. Dette tidspunktet kan variere i en annen dyremodell. For de to avlesningsformatene for CRISPR-Cas-aktiveringsanalyser (fluorescerende vs. papirbasert lateral strømningsanalyse) er det viktig å spore fluorescensbasert kinetikk før sidestrømmen, noe som muliggjør det optimale endepunktet for å lese CRISPR-Cas-spaltningsproduktet.

Denne tilnærmingen er fordelaktig på grunn av inkorporering av doble signalforsterkningstrinn fra proteolytisk og CRISPR-Cas-mediert enzymatisk aktivering, og multipleksingsevnen til å fange kompleksiteten av sykdommen. Utvidelse av multipleksiteten til sensorene vil kreve nøye materialdosering, samt utvide gjennomstrømningen av avlesningen for å opprettholde bærbarhet og brukervennlighet. Denne strategien krever en grundig karakterisering av proteaseaktivitet i flere modeller og spesifisiteten til den proteolytiske profilen mot en bestemt sykdom eller sykdomsstadium. Videre, mens sensorinjeksjon er mindre invasiv enn mange av de diagnostiske alternativene som biopsi, kan intravenøs injeksjon stole på trente flebotomister for sensoradministrasjon, noe som potensielt begrenser brukssaken til sykdomsovervåking i stedet for første deteksjon i en klinisk setting. I tillegg til systemisk injeksjon kan DNA-strekkodede nanosensorer videreutvikles med formuleringer som kan påføres via ikke-invasiv oral, inhalert og aktuell levering, for å muliggjøre bærbar sykdomsdeteksjon og enkel selvovervåking av sykdomsprogresjon og terapivurdering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.N.B., L.H. og R.T.Z. er oppført som oppfinnere på en patentsøknad relatert til innholdet i dette arbeidet. S.N.B. har eierandeler i Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, og er direktør i Vertex; konsulterer for Moderna, og mottar sponset forskningsfinansiering fra Johnson & Johnson, Revitope og Owlstone.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet delvis av et Koch Institute Support Grant nummer P30-CA14051 fra National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), en Core Center Grant P30-ES002109 fra National Institute of Environmental Health Sciences, Koch Institute's Marble Center for Cancer Nanomedicine, Koch Institute Frontier Research Program via Kathy og Curt Marble Cancer Research Fund, og Virginia og DK Ludwig Fund for Cancer Research. A.E.V.H. støttes av et NIH-finansiert førdoktorstipendiat (T32GM130546). SNB er en Howard Hughes Medical Institute Investigator. LH støttes av en K99 / R00 Pathway to Independence Award fra National Cancer Institute og oppstartsfinansiering fra Boston University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x NEB Buffer 2.1 New England Biolabs B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group IDT Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column  Agilent HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) GE Healthcare FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) EMD millipore Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine CPC Scientific Custom peptide
crRNAs  IDT See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy JEM-2100F JEOL cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates CPC Scientific Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS) DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM New England Biolabs M0653T
Experimental animals Taconic Biosciences BALB/cAnNTac 6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit Miltenyi Biotec MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry  Bruker Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group JenKem A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9 https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent Invitrogen O11492 ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates IDT Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column GE Healthcare GE28-9909-44 For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
  2. Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
  3. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
  4. Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
  5. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  7. Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
  8. Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
  9. Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
  10. Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
  11. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  12. Choi, H. S., et al. Renal clearance of quantum dots. Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).
  13. Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
  14. Hao, L., et al. Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics. Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).
  15. Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
  16. Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 202
CRISPR-Cas-mediert multianalytt syntetisk urinbiomarkørtest for bærbar diagnostikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Heest, A. E., Deng, F., Zhao, R. … More

Van Heest, A. E., Deng, F., Zhao, R. T., Harzallah, N. S., Fleming, H. E., Bhatia, S. N., Hao, L. CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics. J. Vis. Exp. (202), e66189, doi:10.3791/66189 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter