Summary
Этот протокол описывает CRISPR-Cas-опосредованный мультианалитный синтетический биомаркер мочи, который позволяет диагностировать рак в месте оказания медицинской помощи с помощью анализа активности опухоль-ассоциированной протеазы ex vivo.
Abstract
Создание синтетических биомаркеров для разработки прецизионной диагностики позволило выявлять заболевания с помощью путей, выходящих за рамки тех, которые используются для традиционных измерений биожидкости. Синтетические биомаркеры, как правило, используют репортеры, которые обеспечивают читаемые сигналы в биожидкости, чтобы отразить биохимические изменения в локальном микроокружении болезни во время заболеваемости и прогрессирования заболевания. Фармакокинетическая концентрация репортеров и биохимическая амплификация сигнала заболевания имеют первостепенное значение для достижения высокой чувствительности и специфичности диагностического теста. Здесь платформа для диагностики рака построена с использованием одного из форматов синтетических биомаркеров: основанных на активности наносенсоров, несущих химически стабилизированную ДНК-репортеры, которые могут быть высвобождены аберрантными протеолитическими сигнатурами в микроокружении опухоли. Синтетическая ДНК в качестве источника информации о заболевании обеспечивает возможность мультиплексирования благодаря использованию в качестве штрих-кода, что позволяет считывать несколько протеолитических сигнатур одновременно. ДНК-репортеры, высвобождаемые в мочу, обнаруживаются с помощью нуклеаз CRISPR путем гибридизации с РНК CRISPR, которые, в свою очередь, производят флуоресцентный или колориметрический сигнал при активации фермента. В этом протоколе конструируются наносенсоры со штрих-кодом ДНК, основанные на активности, и их применение иллюстрируется на доклинической мышиной модели метастатического колоректального рака. Эта система легко модифицируется в соответствии с биологией заболевания и генерирует несколько сигналов заболевания одновременно, обеспечивая всестороннее понимание характеристик заболевания с помощью минимально инвазивного процесса, требующего только введения нанодатчиков, сбора мочи и бумажного теста, который позволяет проводить диагностику в месте оказания медицинской помощи.
Introduction
Несмотря на значительные усилия по выявлению опухолевых биомаркеров, таких как выделенные белки и ДНК, область диагностики рака была напряжена из-за их низкой распространенности или быстрой деградации в кровообращении. В качестве дополнительной стратегии биоинженерные синтетические биомаркеры, которые избирательно реагируют на особенности заболевания для генерации усиленных сигналов, представляют собой новые возможности для точной и доступной диагностики 2,3. Чтобы облегчить обнаружение, эти синтетические биомаркеры используют опухолезависимые механизмы активации, такие как ферментативная амплификация, для получения аналитов с улучшенным отношением сигнал/шум4. При этом класс ферментов, связанных с раком, протеаз, используется для активации инъекционных наноразмерных сенсоров для высвобождения сигналов о заболевании, обнаруживаемых из биожидкостей, таких как кровь илимоча. В свете гетерогенности опухоли разработка панели сенсоров, активируемых протеазой, позволяет проводить мультианалитические тесты, которые объединяют различные события расщепления протеазы в «сигнатуру заболевания» для оценки заболеваемости и прогрессирования рака более специфичным, мультиплексным образом.
Были разработаны синтетические биомаркеры, активируемые протеазой, которые содержат пептидные субстраты, конъюгированные с поверхностью инертного носителя7. При введении in vivo эти пептиды переносятся в опухоль, после чего ферментативное расщепление опухолевыми протеазами высвобождает репортеров в кровь или мочу для обнаружения. Мультиплексное обнаружение с помощью синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, требует, чтобы каждый синтетический биомаркер в составе коктейля был помечен уникальным молекулярным штрих-кодом. С этой целью были разработаны различные подходы, в том числе массовые штрих-коды и лиганд-кодированные репортеры 8,9,10. В отличие от этих методов мультиплексирования, которые могут быть ограничены несколькими различными сигнальными возможностями, штрих-кодирование ДНК позволяет получить гораздо больше комбинаций в соответствии с высокой сложностью и гетерогенностью болезненных состояний человека. Чтобы расширить мультиплексность синтетических биомаркеров, датчики получают штрих-код, помечая каждого репортера уникальной последовательностью ДНК для обнаружения с помощью нуклеазы CRISPR-Cas для усиления биофлюидного сигнала ex vivo. Эти штрих-коды одноцепочечной ДНК (ssDNA) предназначены для связывания с комплементарными направляющими РНК CRISPR (crRNAs), активируя активность коллатеральной нуклеазы CRISPR-Cas12a11. Эта нуклеазная активность может быть использована для расщепления репортерной цепи ДНК, обнаруженной с помощью кинетики флуоресценции или с помощью бумажных полосок.
В дополнение к молекулярной амплификации с помощью протеаз (in vivo) и CRISPR-Cas (ex vivo), еще одной ключевой особенностью конструкции синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, является использование фармакокинетики наноматериалов для увеличения концентрации диагностических сигналов в биожидкостях10. Одним из подходов является использование носителя наночастиц для увеличения времени циркуляции поверхностно-конъюгированных пептидных субстратов. В качестве наноносителя с относительно небольшим гидродинамическим диаметром и мультивалентностью выбран дендример полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения доставки к опухолям. Несмотря на то, что он достаточно мал, чтобы способствовать доставке опухоли, размер носителя ПЭГ больше, чем граница размера ~5 нм барьера фильтрации клубочков почек, так что только расщепленные пептидные субстраты могут быть очищены в моче, используя преимущества фильтрации по размеру почками12. В этом протоколе описан многоступенчатый рабочий процесс для синтеза и применения наносенсоров, основанных на активности ДНК со штрих-кодом, в доклинической мышиной модели, подчеркивая настройку CRISPR-Cas-опосредованного, мультианализируемого синтетического биомаркера мочи, который был использован этой группой для классификации статуса заболевания в мышиных моделях нескольких типов рака13. Благодаря универсальному принципу конструкции все три функциональных компонента наносенсора - наноноситель (полимер ПЭГ), модуль, реагирующий на стимулы (субстрат, активируемый протеазой) и биофлюидный репортер (штрих-код ДНК) - могут быть точно взаимозаменяемы в соответствии с потребностями конкретного применения, что обеспечивает модульность за счет адаптации к мишени и особенностям выпуска.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных одобряются Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в учреждении авторов. Для надлежащего проведения этих экспериментов требуются стандартные помещения по уходу за животными, включая камеры содержания, стерильные капюшоны, анестезию и этичную конечную эвтаназию. Все эксперименты проводятся в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями и под наблюдением ветеринарного персонала учреждения. Самки мышей линии BALB/c, использованные для экспериментов, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов) и имели возраст от 6 до 8 недель в начале исследования. Последовательности для специально синтезированных ДНК, крРНК, пептидных субстратных зондов на основе FRET и сенсорных пептидов представлены в дополнительной таблице 1.
1. Выбор пептидного субстрата, активируемого протеазой
- Сбор и подготовка образцов тканей из здоровых легких или легочной ткани с опухолевыми узелками в соответствии с ранее опубликованным отчетом13.
- Гомогенизируйте ткани в предварительно охлажденном фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) (200 мг ткани/мл PBS) с помощью тканевых диссоциационных трубок для автоматической диссоциации тканей на одноклеточные суспензии.
- Центрифуга гомогенирует ткани при 6 000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Задержите надосадочную жидкость в новой пробирке.
- Центрифугу надосадочной жидкости при 14 000 x g в течение 25 мин при 4 °C.
- Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белков бисинхониновой кислоты (BCA) (см. таблицу материалов).
- Добавьте PBS в образец для приготовления раствора 0,33 мг/мл.
- Оцените протеолитическую активность, выполнив следующие действия.
- В 384-луночном планшете добавьте 5 мкл, 6 мкМ пептидных субстратов на основе FRET в каждую лунку. Для каждого зонда выполните реакцию в трех экземплярах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пептидный субстратный зонд на основе FRET содержит короткую пептидную последовательность (6-8 аминокислот, специфичных для целевой протеазы или группы протеаз), оканчивающуюся парой флуорофор и гаситель. В качестве примера в Дополнительной таблице 1 описаны два FRET-зонда. Полную библиотеку зондов можно найти в Hao et al.13. См. - Центрифугируйте луночный планшет в течение 10 секунд при комнатной температуре при 180 x g , чтобы убедиться, что зонды находятся на дне планшета.
- Добавьте 25 мкл 0,33 мг/мл образца ткани или 40 мкМ рекомбинантной протеазы13 в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация образца ткани или рекомбинантной протеазы может быть оптимизирована в соответствии с их собственной протеолитической активностью. Например, высокопротеолитические ткани, такие как кишечник, могут требовать более высоких коэффициентов разбавления, чтобы обеспечить мониторинг начального ферментативного расщепления. - Кратковременно центрифугируйте луночный планшет при 180 x g (при комнатной температуре), чтобы смешать зонды и тканевые лизаты.
- Немедленно приступайте к обнаружению расщепления зонда, измеряя флуоресценцию с помощью планшетного ридера при 37 °C каждые 2 минуты в течение 1 ч (λex: 485 нм; λem: 535 нм) для контроля спайности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие длины волн возбуждения и излучения для определенных пар флуорофора и гасителя. В данном исследовании для флуорофора FAM задаются параметры (λex: 485 нм и λem: 535 нм). - Для анализа данных флуоресцентных измерений используйте пакет Python (см. Таблицу материалов) для анализа кинетики ферментов, доступный в https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Этот скрипт вычисляет начальную скорость реакции (V0), используя наклон линейной аппроксимации первых 8-10 начальных временных точек.
- В 384-луночном планшете добавьте 5 мкл, 6 мкМ пептидных субстратов на основе FRET в каждую лунку. Для каждого зонда выполните реакцию в трех экземплярах.
2. Формулировка и определение характеристик датчика
- Синтезируют конъюгат ДНК и пептида, активируемого протеазой (PAP).
- Инкубируют 20-мерные фосфоротиационные репортеры ДНК с 3'-DBCO группой (1,1 экв., см. таблицу материалов) с азид-концевыми ПАП с С-концевым цистеиновым концом в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,0) при комнатной температуре в течение >4 ч. Если оставить на ночь, инкубируйте при 4 °C.
- Очистите продукт с помощью высокоэффективной системы жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оснащенной колонкой, идеально подходящей для биомолекул (см. Таблицу материалов). Установите градиент ВЭЖХ так, чтобы он начинался с 5% буфера А (0,05% ТЖК в H2O), выдерживали изократический в течение 20 мин и достигали буфера 80% B (0,05% ТЖК, 99,95% ацетонитрила) через 65 мин с расходом 0,3 мл мин-1 и собирали сопряженный продукт со временем удержания при ~31 мин.
- Валидация очищенных конъюгатов с помощью масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией во время пролета (MALDI-TOF) с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы14 (см. таблицу материалов).
- Синтез ДНК-кодируемых наносенсоров на основе активности.
- Растворяют 2 мг поливалентного ПЭГ (40 кДа, 8-плечо, см. таблицу материалов) с малеимидно-реактивной группой в 1 мл 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,0) и фильтра (отсечка: 0,2 мкм).
- Добавьте концевые конъюгаты ДНК-пептидов (2 экв., см. таблицу материалов) к ПЭГ и реагируйте при комнатной температуре в течение >4 ч. Если оставить на ночь, инкубируйте при 4 °C.
- Удаляют неконъюгированные материалы с помощью эксклюзионной хроматографии с коммерчески доступной композитной матричной колонкой декстрана-агарозы на жидкостной хроматографии быстрого белка (FPLC) (см. таблицу материалов). Запускайте образцы в PBS и контролируйте поглощение на длине волны 260 нм для ДНК и 280 нм для пептида.
- Сконцентрировать синтезированные наносенсоры центробежными фильтрующими трубками (MWCO = 10 кДа) в соответствии с рекомендуемой производителем скоростью (см. таблицу материалов).
- Количественно определите концентрацию ДНК с помощью набора для анализа ssDNA (см. таблицу материалов) и планшетного ридера при λex: 485 нм и λem: 535 нм. Храните наносенсоры при температуре 4 °C.
- Охарактеризовать ДНК-кодируемые наносенсоры, основанные на активности.
- Измерение гидродинамического размера частиц наносенсоров, кодируемых в ДНК, с помощью динамического рассеяния света (DLS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый диапазон размеров наносенсоров составляет 15-50 нм, со средним размером 20-30 нм. Если требуется ограниченный диапазон размеров, FPLC (на этапе 2.3) можно использовать для выделения более узких фракций с различной молекулярной массой. - Концентрируют наносенсоры до 0,5 мг/мл (по концентрации ДНК) с помощью центробежных фильтрующих трубок (MWCO = 10 кДа) и загружают образцы на медную сетку с углеродным покрытием, установленную на криодержателе. Наблюдение морфологии с помощью криогенной просвечивающей электронной микроскопии (200 кВ, увеличение 10 000–60 000)14.
- Измерение гидродинамического размера частиц наносенсоров, кодируемых в ДНК, с помощью динамического рассеяния света (DLS).
3. Инъекция датчика и сбор мочи
- Соберите мочу для базового измерения.
- Поместите мышь в специальную камеру корпуса (см. дополнительный рисунок 1) с 96-луночной пластиной в качестве основания.
- Удерживайте мышь и слегка надавите на мочевой пузырь, чтобы опорожнить оставшуюся мочу на тарелку.
- Скопив собранную мочу (~100-200 мкл) из 96-луночного планшета в пробирку объемом 1,5 мл после замены мыши на нормальный корпус.
- Создание доклинической модели мышиной опухоли.
- Инокуляцию 6-8-недельным самкам мышей BALB/c путем внутривенной инъекции клеточной линии MC26-Fluc, экспрессирующей люциферазу (100 тыс. клеток на мышь) (см. таблицу материалов). Еженедельно контролируйте прогрессирование опухоли с помощью системы флуоресцентной визуализации in vivo .
ПРИМЕЧАНИЕ: Видимая опухолевая нагрузка, на которую указывает люминесцентный сигнал, возникает примерно на 2-й неделе после инъекции этой конкретной клеточной линии. Тщательно осматривайте животных с опухолью во время прогрессирования опухоли на регулярной основе.
- Инокуляцию 6-8-недельным самкам мышей BALB/c путем внутривенной инъекции клеточной линии MC26-Fluc, экспрессирующей люциферазу (100 тыс. клеток на мышь) (см. таблицу материалов). Еженедельно контролируйте прогрессирование опухоли с помощью системы флуоресцентной визуализации in vivo .
- Вводите наносенсоры в разные моменты времени после имплантации опухоли.
- Приготовьте раствор для инъекций (максимальный объем 200 мкл), содержащий наносенсоры в концентрации 1 нмоль по штрих-коду ДНК в стерильном PBS.
- Введите 200 мкл раствора сенсора в PBS каждой экспериментальной мыши внутривенно.
- Соберите образцы мочи у здоровых контрольных мышей и мышей с опухолью через 1 ч после введения датчика, как описано в шагах 1.1-1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие образцы мочи могут быть обработаны для анализа штрих-кода ДНК напрямую или сразу же заморожены на льду.
4. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на основе флуоресценции
- Используйте свежие образцы мочи или размораживайте замороженные образцы на льду. Центрифужные образцы мочи при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Смешайте реагенты, указанные в дополнительной таблице 2, добавьте фермент Cas12a (см. таблицу материалов) в последнюю очередь и осторожно перемешайте реакцию путем пипетирования вверх и вниз. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 30 мин.
- Запустите реакцию репортера, как показано в дополнительной таблице 3, в трех экземплярах, используя произведение шага 2. Добавьте реакцию из шага 2 в последнюю очередь и быстро поднесите к считывающему устройству.
- Обнаруживайте активацию LbaCas12a, измеряя флуоресценцию с помощью планшетного ридера при 37 °C каждые 2 минуты в течение 3 ч (λex: 485 нм и λem: 535 нм) для мониторинга кинетики расщепления ДНК-репортера.
- Для анализа данных флуоресцентных измерений используйте пакет Python для анализа кинетики ферментов, доступный в https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Этот скрипт вычисляет начальную скорость реакции (V0), используя наклон линейной аппроксимации первых 8-10 начальных временных точек.
5. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на бумажной основе
- Центрифужные образцы мочи при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно запускайте образцы мочи для обнаружения CRISPR на основе флуоресценции и на бумаге. - Комбинируйте реагенты, указанные в дополнительной таблице 2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап инкубации идентичен этапу обнаружения CRISPR на основе флуоресценции. - Запустите репортерную реакцию с использованием ДНК-репортера, меченного FAM-биотином, для анализа бокового потока на бумажной полоске (см. таблицу материалов). Объедините реагенты, указанные в дополнительной таблице 4 , в 96-луночный планшет, используя произведение шага 2. Накрыть алюминиевой фольгой и инкубировать при 37 °C в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите оптимальное время инкубации в соответствии с мониторингом кинетики в режиме реального времени в флуоресцентном анализе обнаружения CRISPR, описанном выше. - В свежую лунку 96-луночного планшета добавьте 80 мкл PBS. Добавьте в эту лунку 20 мкл образца с этапа 3.
- Поместите по одной бумажной полоске бокового потока в каждую лунку и подождите, пока жидкость не достигнет верхней части полоски (<5 минут). Обратите внимание на внешний вид контрольной полосы и/или полосы (полос) для образцов на бумажной полоске.
- Сфотографируйте полосу бокового потока и количественно оцените интенсивность полосы с помощью ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Номинирование пептидных субстратов, активируемых протеазой
Для разработки сенсоров, которые будут отражать изменения протеолитической активности ткани, активность протеазы в ткани сначала характеризуют с помощью библиотеки пептидных зондов13 (рис. 1). Свежие и замороженные образцы тканей могут дать существенную информацию о протеолитической активности микроокружения опухоли путем объединения образцов тканей с зондами FRET, предназначенными для обнаружения расщепления субстрата. Библиотека зондов FRET с флуорофором FAM и гасителем CPQ-2 инкубируется с образцами тканей. Зонды с наибольшей разницей в скорости расщепления между фиктивной тканью и опухолевой тканью, измеренной методом флуоресцентной спектрофотометрии, выбираются в качестве пептидных линкеров для использования в наносенсорах in vivo (рис. 1A). Чтобы лучше понять физиологию опухолевой среды и эффективно сравнить профили экспрессии протеаз с профилями активности, зонды FRET могут быть инкубированы с рекомбинантными протеазами, чтобы ассоциировать расщепление субстрата со специфической активностью протеазы, как показано на примере двух зондов на рисунке 1B.
Формулировка и определение характеристик датчиков
Наносенсоры состоят из полимерного ядра, пептидов и одноцепочечных штрих-кодов ДНК, как показано на рисунке 2A. Полимерные сердечники представляют собой дендримеры ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа, которые выступают в качестве переносчиков до 8 конъюгатов пептид-ДНК (рис. 2B). Пептиды, ~1,4 кДа, соединяют ядро и ДНК с аминокислотной последовательностью, предназначенной для расщепления за счет протеолитической активности. Одноцепочечный штрих-код ДНК имеет длину 20 пар оснований, ~6,8 кДа, и химически модифицирован для улучшения стабильности in vivo. После конъюгации конструкция пептид-ДНК очищается с помощью ВЭЖХ, что позволяет разделить конъюгированные и свободные составляющие (рис. 2C). Масс-спектрометрический анализ показал, что молекулярная масса конъюгата составляет 8,283 кДа, что ожидаемо, учитывая, что молекулярная масса пептида и штрих-кода ДНК составляет 1,4 кДа и 6,8 кДа соответственно. Конъюгат пептид-ДНК далее конъюгируется с дендримером ПЭГ. Полученный сенсор очищают с помощью FPLC для удаления свободной пептидной ДНК, которая демонстрирует более длительное время удержания по сравнению с ПЭГилированными (рис. 2D). Размер сенсора может быть охарактеризован с помощью динамического рассеяния света и криогенной просвечивающей электронной микроскопии, которые указывают на увеличение диаметра после добавления пептидной ДНК в ядро с ~8 нм до ~20 нм (рис. 2B). Дисперсия в размере частиц может быть обусловлена гибкостью составляющих цепей и переменным числом плеч пептидной ДНК, конъюгированных с каждым дендримером ПЭГ.
Доклиническая модель болезни мышей
Работа in vivo по тестированию сенсоров включает в себя установление опухолей в течение 3 недель в легких мышей BALB/c, введение наносенсоров и сбор мочи через 1 ч после введения датчика (рис. 3A). Исходный образец мочи также берется перед инокуляцией опухоли для сравнения с образцами после индукции заболевания. Чтобы оценить эффективность сенсора в выявлении злокачественных новообразований, внутривенно вводят клеточную линию колоректального рака MC26 (MC26-Fluc) с экспрессией люциферазы, в результате чего при люминесцентной визуализации in vivo образуются узлы опухоли легких. Окрашивание гематоксилином и эозином13 выявляет гистопатологию легочной ткани у мышей с опухолью и мышей с фиктивной контрольной группой, соответственно, и признаки образования опухоли через 11 и 21 день после инъекции, как показано черными стрелками на рисунке 3B.
Активация CRISPR химически стабилизированной ДНК
Для оптимизации активации Cas12a с помощью штрих-кодов ssDNA и комплементарного спаривания crRNA были протестированы различные олигонуклеотидные последовательности и длины. Активация Cas12a оценивается путем измерения увеличения флуоресценции с течением времени из-за расщепления Cas12a репортера ДНК свидетеля с помощью FRET спаривания. Увеличение скорости расщепления связано с более высокими концентрациями химически модифицированного штрих-кода мцДНК, как показано на примере репрезентативной пары крРНК/штрих-код (рис. 4B). Важно отметить, что линейная зависимость между концентрацией и активацией, показанная на рисунке 4B, позволяет считывать информацию о присутствии штрих-кода ДНК в моче и косвенно отражать протеолитическую активность in vivo. Кроме того, несколько различных последовательностей крРНК, как подробно описано в Дополнительной таблице 1, могут быть использованы для активации Cas12a, что имеет решающее значение для мультиплексирования. Активаторы ДНК были выбраны для создания сенсоров in vivo на основе их сходства в производительности анализа. Химически модифицированная мцДНК, имеющая решающее значение для стабильности синтетического биомаркера in vivo , продемонстрировала активацию Cas12a по сравнению с немодифицированными дцДНК и мцДНК (рис. 4В).
Мультиплексное детектирование химически стабилизированных штрихкодов ДНК в моче
Множественные пары активаторов одноцепочечной ДНК (ssDNA), модифицированных crRNA, были проверены на их ортогональность между различными последовательностями. Это позволяет одновременно считывать данные в нескольких скважинах, как показано на рисунке 5A. Кроме того, модифицированные молекулы ДНК в необработанной моче могут быть обнаружены с помощью колориметрического считывания на бумажных полосках с боковым потоком, как показано на рисунке 5B. Наличие ведущей «полосы образцов» указывает на высвобождение обнаруживаемого FAM через репортерное расщепление после того, как Cas12a запускается мочевой ДНК. Когда Cas12a активируется активатором ДНК в моче мыши, он расщепляет флуоресцеин (FAM)-биотин-парный олигонуклеотидный репортер, высвобождая молекулу FAM, которая затем обнаруживается в «полосе образцов». Нерасщепленные репортеры попадают на «контрольную полосу» из-за связывания биотина со стрептавидином. Наносенсоры отбираются для экспериментов in vivo и конструируются с использованием пептидов, активируемых протеазой, и различных штрих-кодов ДНК. Пептиды номинируются с помощью профилирования тканей ex vivo (рис. 1A), а штрих-коды ДНК подбираются на основе аналогичной активации Cas12a (рис. 4B).
Рисунок 1: Идентификация пептидных субстратов, активируемых дисрегулируемыми протеазами при колоректальном раке, для конструирования сенсоров. (A) FRET-парные пептидные субстраты, каждый из которых состоит из пептидной последовательности, окруженной флуорофором FAM и гасителем CPQ-2, проверяются на наличие рекомбинантных протеолитических ферментов или тканевых гомогенатов. (B) Репрезентативная кинетика расщепления протеазы FRET-парных пептидных субстратов (зонды 1 и 2). Рисунок адаптирован из Hao et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика ДНК-штрих-кодированного активностного наносенсора с полимерным ПЭГ-сердечником. (A) Наносенсоры со штрих-кодом ДНК содержат полимерный наноноситель (8-плечевой ПЭГ), функционализированный пептидами, активируемыми протеазой, штрих-кодированными олигонуклеотидами. (B) Анализ динамического рассеяния света показывает увеличение размера частиц с 8,3 нм (только сердечник PEG) до 13 нм (функционализированный датчик). (C) ВЭЖХ очистка конъюгата пептид-ДНК. Конъюгат анализируется в масс-спектрометрии и показывает ожидаемую молекулярную массу. (D) Очистка сенсора с помощью FPLC показывает разделение функционализированного сенсора и неограниченного конъюгата пептид-ДНК. Рисунок адаптирован из Hao et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Индукция заболевания in vivo и использование сенсоров. (A) График продольного мониторинга опухолей с помощью наносенсора в различные моменты времени развития опухоли. (B) Гистологическое окрашивание легких мышей с BALB/c с опухолями легких с КРР на 11- и 21-й день после инокуляции опухоли и введенных физиологическим раствором контрольных мышей Sham. Масштабная линейка = 200 мкм. Органы фиксировали, погружали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование проводилось с n = 3 мышами в каждый момент времени, и были показаны изображения репрезентативного животного. Стрелками обозначены опухолевые узелки в легком. Рисунок адаптирован из Hao et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Активация Cas12a химически стабилизированными активаторами ДНК. (A) Активация Cas12a репрезентативным штрих-кодом ssDNA путем связывания с комплементарной крРНК приводит к трансрасщеплению ДНК свидетеля дозозависимым образом, измеряемым интенсивностью флуоресценции с помощью спектрофотометра. (B) Начальная скорость реакции (V0) определяется по наклону кривой в начале реакции в (A) и строится для определения линейного диапазона производительности анализа. (C) Активация Cas12a двухцепочечными, одноцепочечными и химически модифицированными активаторами ДНК. Рисунок адаптирован из Hao et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Мультиплексное считывание штрих-кода ДНК, опосредованное CRISPR-Cas12, с двумя вариантами детектирования. (A) Скорость трансрасщепления Cas12a при активации различных модифицированных пар ssDNA активатор-crРНК определяется в флуоресцентном анализе расщепления Cas12a. Анализы проводят с образцами мочи, взятыми у мышей, которым вводили 1 нмоль модифицированного активатора мцДНК через 1 ч после внутривенного введения. Рисунок адаптирован из Hao et al.13. (B) Бумажное считывание образца мочи Cas12a с колориметрическими изменениями появляется в разных местах бумажной полоски. Верхняя полоса - от расщепленного репортера FAM ДНК, а нижняя - от нерасщепленного репортера FAM-биотина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Камера для сбора мочи, расположенная над 96-луночной пластиной. Мышь временно помещается внутрь цилиндра для мочеиспускания в 96-луночную пластину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 1: Олиго- и пептидные последовательности для составления сенсоров и CRISPR-анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 2: Реактивы для реакции Cas12a на флуоресцентной и бумажной основе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 3: Реагенты репортерной реакции для флуоресцентного детектирования CRISPR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 4: Реагенты репортерной реакции для обнаружения CRISPR на бумаге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлена платформа с широкими возможностями настройки для мультиплексного обнаружения рака с портативным анализом мочи, который оценивает протеолитическую активность, связанную с заболеванием, с помощью минимально инвазивного инъекционного датчика. При активации опухолевыми протеазами расщепление пептидного субстрата усиливается путем высвобождения штрих-кода ДНК в мочу. Синтетические ДНК-репортеры в образце мочи могут быть прочитаны с помощью вторичной ферментативной амплификации, опосредованной CRISPR-Cas, с использованием флуорометрического обнаружения или простого бумажного теста. Штрих-кодирование ДНК является привлекательным методом маркировки синтетических биомаркеров для обеспечения мультиплексности. Повышение стабильности штрих-кодов ДНК с помощью химической модификации является обязательным условием для поддержания стабильности наносенсоров in vivo. В частности, обнаружение штрих-кодов ДНК с помощью CRISPR-Cas12a может быть активировано с помощью полностью модифицированных фосфоротиоатом штрих-кодов ДНК со стабилизированной основой. Химическая модификация снижает скорость активации CRISPR-Cas12a относительно его нативного аналога ДНК, однако из-за его повышенной стабильности. Кроме того, введение терминальных модификаций в крРНК или тестирование различных модифицированных олигонуклеотидов в штрих-кодах ДНК может еще больше повысить чувствительность CRISPR-опосредованного обнаружения штрих-кода15, тем самым улучшая предел обнаружения (LOD) диагностики рака.
В дополнение к молекулярной амплификации, еще одна ключевая стратегия для достижения LOD, необходимого для раннего выявления рака, включает в себя использование преимуществ фильтрации по размеру почками для концентрации синтетических ДНК-репортеров в моче. С этой целью крайне важно оптимизировать размер штрих-кодов ДНК. 20-мерные ДНК-комплементарные ДНК показали оптимальное считывание штрих-кода ДНК, опосредованное CRISPR-Cas12a, из образцов мочи. Эта оптимальная длина может отличаться при применении к различным нуклеазам CRISPR или доклиническим моделям животных.
Для поддержания воспроизводимости этой системы обнаружения важно провести тщательную характеристику инжекционных наносенсоров, чтобы свести к минимуму вариации от партии к партии. Изменение количества конъюгатов пептид-ДНК в ядре изменит количество штрих-кодов ДНК, высвобождаемых в мочу, и, следовательно, повлияет на окончательное считывание. Точно так же осторожное внутривенное введение датчика поможет обеспечить последовательность дозирования датчика. Для того, чтобы обеспечить надлежащий сбор мочи в объеме не менее 50 мкл от каждого животного в определенный момент времени, поддержание гидратации животного с опухолью имеет решающее значение. Этому можно способствовать, удерживая мышей на несмачивающем водном геле или вводя PBS подкожно за час до сбора мочи16.
Время сбора мочи и продолжительность считывания штрих-кода ДНК, опосредованного CRISPR-Cas, являются критическими факторами для согласованности анализа. Штрих-коды, находящиеся в обращении, претерпевают характерное одноэкспоненциальное снижение концентрации после внутривенной инъекции и зависящей от размера почечной фильтрации из крови, достигая максимума через 1 ч после введения у мышиных моделей13. Этот момент времени может варьироваться в разных моделях животных. Для двух форматов считывания активационных анализов CRISPR-Cas (флуоресцентный и бумажный анализ бокового потока) важно отслеживать кинетику на основе флуоресценции до латерального потока, что позволяет определить оптимальную конечную точку для считывания продукта расщепления CRISPR-Cas.
Преимущество этого подхода заключается в том, что он включает в себя двойные этапы усиления сигнала от протеолитической и CRISPR-Cas-опосредованной ферментативной активации, а также возможность мультиплексирования для учета сложности заболевания. Расширение мультиплексности датчиков потребует тщательного дозирования материала, а также увеличения пропускной способности считывания для сохранения портативности и простоты использования. Эта стратегия требует тщательной характеристики активности протеазы в нескольких моделях и специфичности протеолитического профиля по отношению к конкретному заболеванию или стадии заболевания. Кроме того, несмотря на то, что инъекция с помощью датчика является менее инвазивной, чем многие диагностические альтернативы, такие как биопсия, внутривенная инъекция может полагаться на квалифицированных флеботомистов для введения датчика, что потенциально ограничивает вариант использования мониторингом заболевания, а не первоначальным выявлением в клинических условиях. В дополнение к системным инъекциям, наносенсоры со штрих-кодом ДНК могут быть дополнительно спроектированы с помощью составов, которые могут применяться путем неинвазивного перорального, ингаляционного и местного введения, чтобы обеспечить портативное обнаружение заболевания и легкий самоконтроль прогрессирования заболевания и оценку терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.N.B., L.H. и R.T.Z. указаны в качестве изобретателей в патентной заявке, связанной с содержанием этой работы. S.N.B. владеет долями в Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, а также является директором Vertex; консультирует Moderna и получает спонсируемое финансирование исследований от Johnson & Johnson, Revitope и Owlstone.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантом Института Коха No P30-CA14051 от Национального института рака (Биотехнологический центр Свенсона), грантом Основного центра P30-ES002109 от Национального института наук об окружающей среде, Мраморным центром наномедицины рака Института Коха, Программой передовых исследований Института Коха через Фонд исследования рака Кэти и Курта Марбл. и Фонд Вирджинии и Д. К. Людвига по исследованию рака. A.E.V.H. поддерживается стипендией для подготовки к докторантуре (T32GM130546), финансируемой NIH. С.Н.Б. является следователем Медицинского института Говарда Хьюза. L.H. поддерживается премией K99/R00 Pathway to Independence Award от Национального института рака и финансированием стартапа от Бостонского университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
- Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
- Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
- Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
- Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
- Hanahan, D.
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
- Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Choi, H. S., et al.
- Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
- Hao, L., et al.
- Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
- Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).
