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Bioengineering

पोर्टेबल डायग्नोस्टिक्स के लिए CRISPR-Cas-मध्यस्थता Multianalyte सिंथेटिक मूत्र बायोमार्कर परीक्षण

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/66189
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 3,4, 2,3,4,5,6,7,8, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Howard Hughes Medical Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard, 6Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 8Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School

Summary

यह प्रोटोकॉल एक सीआरआईएसपीआर-कैस-मध्यस्थता, मल्टीएनालाइट सिंथेटिक मूत्र बायोमार्कर परीक्षण का वर्णन करता है जो ट्यूमर से जुड़े प्रोटीज गतिविधियों के पूर्व विवो विश्लेषण के माध्यम से पॉइंट-ऑफ-केयर कैंसर निदान को सक्षम बनाता है।

Abstract

सटीक निदान के विकास के लिए सिंथेटिक बायोमार्कर बनाने से पारंपरिक बायोफ्लुइड माप के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्गों से परे मार्गों के माध्यम से बीमारी का पता लगाने में सक्षम बनाया गया है। सिंथेटिक बायोमार्कर आम तौर पर संवाददाताओं का उपयोग करते हैं जो रोग की घटनाओं और प्रगति के दौरान स्थानीय रोग माइक्रोएन्वायरमेंट में जैव रासायनिक परिवर्तनों को प्रतिबिंबित करने के लिए बायोफ्लुइड में पठनीय संकेत प्रदान करते हैं। पत्रकारों की फार्माकोकाइनेटिक एकाग्रता और रोग संकेत के जैव रासायनिक प्रवर्धन एक नैदानिक परीक्षण में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि हैं। यहां, सिंथेटिक बायोमार्कर के एक प्रारूप का उपयोग करके एक कैंसर डायग्नोस्टिक प्लेटफॉर्म बनाया गया है: रासायनिक रूप से स्थिर डीएनए पत्रकारों को ले जाने वाली गतिविधि-आधारित नैनोसेंसर जिन्हें ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में असामान्य प्रोटियोलिटिक हस्ताक्षर द्वारा मुक्त किया जा सकता है। एक रोग रिपोर्टर के रूप में सिंथेटिक डीएनए बारकोड के रूप में इसके उपयोग के माध्यम से मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता प्रदान करता है, जिससे एक बार में कई प्रोटियोलिटिक हस्ताक्षरों को रीडआउट करने की अनुमति मिलती है। मूत्र में छोड़े गए डीएनए संवाददाताओं को सीआरआईएसपीआर आरएनए के साथ संकरण के माध्यम से सीआरआईएसपीआर न्यूक्लिएज का उपयोग करके पता लगाया जाता है, जो बदले में एंजाइम सक्रियण पर फ्लोरोसेंट या वर्णमिति संकेत उत्पन्न करता है। इस प्रोटोकॉल में, डीएनए-बारकोडेड, गतिविधि-आधारित नैनोसेंसर का निर्माण किया जाता है और उनके आवेदन को मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर के प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल में उदाहरण दिया जाता है। यह प्रणाली रोग जीव विज्ञान के अनुसार अत्यधिक परिवर्तनीय है और एक साथ कई रोग संकेत उत्पन्न करती है, केवल नैनोसेंसर प्रशासन, मूत्र संग्रह और एक पेपर परीक्षण की आवश्यकता होती है जो पॉइंट-ऑफ-केयर निदान को सक्षम बनाता है।

Introduction

शेड प्रोटीन और डीएनए जैसे ट्यूमर बायोमार्कर की पहचान करने के महत्वपूर्ण प्रयास के बावजूद, कैंसर नैदानिक क्षेत्र को उनकी कम बहुतायत या परिसंचरण में तेजी से गिरावट से तनाव हुआ है1. एक पूरक रणनीति के रूप में, bioengineered सिंथेटिक बायोमार्कर है कि चुनिंदा प्रवर्धित संकेत उत्पन्न करने के लिए रोग सुविधाओं का जवाब सटीक और सुलभ निदान 2,3 की दिशा में नए रास्ते का प्रतिनिधित्व करते हैं. पता लगाने में सहायता के लिए, ये सिंथेटिक बायोमार्कर ट्यूमर-निर्भर सक्रियण तंत्र का उपयोग करते हैं जैसे कि एंजाइमेटिक प्रवर्धन बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात4 के साथ विश्लेषण का उत्पादन करने के लिए। इसमें, कैंसर से जुड़े एंजाइमों की एक वर्ग, प्रोटीज, इस तरह के रक्त या मूत्र 5,6 के रूप में biofluids से पता लगाने योग्य रोग संवाददाताओं जारी करने के लिए इंजेक्शन nanoscale सेंसर को सक्रिय करने के लिए लीवरेज कर रहे हैं. ट्यूमर विषमता के प्रकाश में, प्रोटीज़-सक्रिय सेंसर के एक पैनल को विकसित करने से मल्टीएनालाइट परीक्षणों की अनुमति मिलती है जो कैंसर की घटनाओं और प्रगति का आकलन करने के लिए विभिन्न प्रोटीज़ दरार घटनाओं को 'रोग हस्ताक्षर' में जोड़ते हैं।

प्रोटीज-सक्रिय सिंथेटिक बायोमार्कर विकसित किए गए हैं जिनमें पेप्टाइड सब्सट्रेट शामिल हैं जो एक अक्रिय वाहक7 की सतह पर संयुग्मित हैं। जब विवो में इंजेक्शन दिया जाता है, तो इन पेप्टाइड्स को ट्यूमर में ले जाया जाता है, जहां ट्यूमर प्रोटीज द्वारा एंजाइमेटिक क्लीवेज का पता लगाने के लिए रक्त या मूत्र में रिलीज होता है। प्रोटीज़-सक्रिय सिंथेटिक बायोमार्कर के साथ मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन के लिए कॉकटेल के भीतर प्रत्येक सिंथेटिक बायोमार्कर को एक अद्वितीय आणविक बारकोड के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है। यह अंत करने के लिए, विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किया गया है, बड़े पैमाने पर बारकोड और लिगैंड एन्कोडेड पत्रकारों 8,9,10 सहित. मल्टीप्लेक्सिंग के इन तरीकों के विपरीत, जो कुछ अलग सिग्नल संभावनाओं तक सीमित हो सकते हैं, डीएनए बारकोडिंग मानव रोग राज्यों की उच्च जटिलता और विषमता के अनुसार कई और संयोजन प्रदान करता है। सिंथेटिक बायोमार्कर की बहुलता का विस्तार करने के लिए, सेंसर को प्रत्येक रिपोर्टर को CRISPR-Cas न्यूक्लिएज के माध्यम से पता लगाने के लिए एक अद्वितीय डीएनए अनुक्रम के साथ लेबल करके बारकोड किया जाता है ताकि बायोफ्लुइडिक सिग्नल पूर्व विवो को बढ़ाया जा सके। ये एकल-फंसे डीएनए (ssDNA) बारकोड पूरक CRISPR गाइड RNAs (crRNAs) को बांधने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, जो CRISPR-Cas12a11 की लक्ष्य-ट्रिगर संपार्श्विक न्यूक्लीज़ गतिविधि को सक्रिय करते हैं। इस न्यूक्लीज गतिविधि को प्रतिदीप्ति कैनेटीक्स के माध्यम से या पेपर स्ट्रिप्स का उपयोग करके पता लगाए गए रिपोर्टर डीएनए स्ट्रैंड को क्लीव करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

प्रोटीज (विवो में) और सीआरआईएसपीआर-कैस (पूर्व विवो) के माध्यम से आणविक प्रवर्धन के अलावा, प्रोटीज़-सक्रिय सिंथेटिक बायोमार्कर की एक अन्य प्रमुख डिजाइन विशेषता में बायोफ्लुइड10 में नैदानिक सिग्नल एकाग्रता बढ़ाने के लिए नैनोमटेरियल फार्माकोकाइनेटिक्स का उपयोग करना शामिल है। एक दृष्टिकोण सतह-संयुग्मित पेप्टाइड सब्सट्रेट के परिसंचरण समय को बढ़ाने के लिए एक नैनोपार्टिकल वाहक का उपयोग है। एक पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) डेंड्रिमर को ट्यूमर को डिलीवरी बढ़ाने के लिए अपेक्षाकृत छोटे हाइड्रोडायनामिक व्यास और बहुलता के साथ नैनोकैरियर के रूप में चुना जाता है। जबकि ट्यूमर वितरण को बढ़ावा देने के लिए काफी छोटा है, खूंटी वाहक का आकार गुर्दे ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा के ~ 5 एनएम आकार कट-ऑफ से बड़ा है ताकि केवल क्लीव्ड पेप्टाइड सब्सट्रेट मूत्र में साफ किया जा सके, गुर्दे12 द्वारा आकार निस्पंदन का लाभ उठा रहा है। इस प्रोटोकॉल में, बहु-चरण वर्कफ़्लो संश्लेषण और एक प्रीक्लिनिकल murine मॉडल में डीएनए-बारकोडेड गतिविधि-आधारित नैनोसेंसर के अनुप्रयोग के लिए उल्लिखित है, जो CRISPR-Cas-मध्यस्थता, multianalyte सिंथेटिक मूत्र बायोमार्कर परीक्षण के सेटअप को उजागर करता है, जिसे इस समूह द्वारा कई कैंसर प्रकारों के murine मॉडल में रोग की स्थिति को वर्गीकृत करने के लिए नियोजित किया गया है13. बहुमुखी डिजाइन सिद्धांत के कारण, नैनोसेंसर के सभी तीन कार्यात्मक घटक - नैनोकैरियर (पीईजी बहुलक), उत्तेजना-उत्तरदायी मॉड्यूल (प्रोटीज़-सक्रिय सब्सट्रेट), और बायोफ्लुइडिक रिपोर्टर (डीएनए बारकोड) - अनुप्रयोग-विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार ठीक से इंटरचेंज किया जा सकता है, लक्ष्य और रिलीज विशिष्टताओं को सिलाई करके मॉड्यूलरिटी की अनुमति देता है।

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Protocol

सभी पशु अध्ययन लेखकों की संस्था में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित हैं। आवास कक्षों, बाँझ हुड, संवेदनाहारी, और नैतिक समापन बिंदु इच्छामृत्यु सहित मानक पशु देखभाल सुविधाओं को ठीक से इन प्रयोगों को पूरा करने की आवश्यकता है। सभी प्रयोग संस्थागत और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुपालन में आयोजित किए जाते हैं और संस्थान में पशुचिकित्सा कर्मचारियों द्वारा पर्यवेक्षण किया जाता है। प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले मादा बीएएलबी / सी चूहों, एक वाणिज्यिक स्रोत ( सामग्री की तालिकादेखें) से प्राप्त किए जाते हैं और अध्ययन की शुरुआत में 6 से 8 सप्ताह की उम्र में होते हैं। कस्टम-संश्लेषित डीएनए, सीआरआरएनए के लिए अनुक्रम, झल्लाहट आधारित पेप्टाइड सब्सट्रेट जांच, और सेंसर पेप्टाइड्स पूरक तालिका 1में प्रदान किए जाते हैं।

1. प्रोटीज-सक्रिय पेप्टाइड सब्सट्रेट चयन

  1. एकत्र करें और एक पहले से प्रकाशित रिपोर्ट13 के बाद ट्यूमर नोड्यूल के साथ स्वस्थ फेफड़े या फेफड़ों के ऊतकों से ऊतक के नमूने तैयार करते हैं.
    1. एकल-कोशिका निलंबन में ऊतकों के स्वचालित पृथक्करण के लिए ऊतक पृथक्करण ट्यूबों के साथ पूर्व-ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) (200 मिलीग्राम ऊतक/एमएल पीबीएस) में ऊतकों को समरूप करें।
    2. अपकेंद्रित्र ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 6,000 x ग्राम पर समरूप होता है। एक नई ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला बनाए रखें.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिन के लिए 14,000 x ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र।
    4. बाइसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    5. एमएल समाधान तैयार करने के लिए नमूने में पीबीएस जोड़ें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए प्रोटियोलिटिक गतिविधि का आकलन करें।
    1. एक 384 अच्छी तरह से थाली में, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 5 माइक्रोन, 6 माइक्रोन झल्लाहट आधारित पेप्टाइड सब्सट्रेट जांच जोड़ें. प्रत्येक जांच के लिए, तीन प्रतियों में प्रतिक्रिया करते हैं.
      नोट: झल्लाहट आधारित पेप्टाइड सब्सट्रेट जांच एक फ्लोरोफोर और क्वेंचर जोड़ी के साथ समाप्त एक छोटे पेप्टाइड अनुक्रम (6-8 एमिनो एसिड, एक लक्ष्य प्रोटीज या प्रोटीज के समूह के लिए विशिष्ट होने के लिए डिज़ाइन किया गया) शामिल है. दो झल्लाहट जांच एक उदाहरण के रूप में पूरक तालिका 1 में वर्णित हैं. जांच की पूरी लाइब्रेरी हाओ एट अल में पाई जा सकती है।13.
    2. जांच प्लेट के नीचे कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए 180 x ग्राम पर कमरे के तापमान पर 10 एस के लिए अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से 25 माइक्रोन 0.33 मिलीग्राम/एमएल ऊतक नमूना या 40 माइक्रोन पुनः संयोजक प्रोटीज13 जोड़ें।
      नोट: ऊतक के नमूने या पुनः संयोजक प्रोटीज की अंतिम एकाग्रता को उनकी आंतरिक प्रोटियोलिटिक गतिविधि के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, आंतों जैसे अत्यधिक प्रोटियोलिटिक ऊतकों को प्रारंभिक एंजाइमी दरार की निगरानी की अनुमति देने के लिए उच्च कमजोर पड़ने वाले कारकों की आवश्यकता हो सकती है।
    4. जांच और ऊतक lysates मिश्रण करने के लिए 180 x ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर अच्छी तरह से थाली संक्षेप में अपकेंद्रित्र.
    5. दरार की निगरानी के लिए तुरंत 1 घंटे (λपूर्व: 485 एनएम; λem: 535 एनएम) के लिए हर 2 मिनट में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट रीडर के साथ प्रतिदीप्ति को मापकर जांच दरार का पता लगाना शुरू करें।
      नोट: विशिष्ट फ्लोरोफोर और क्वेंचर जोड़े के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें। इस अध्ययन के मामले में, पैरामीटर (λपूर्व: 485 एनएम और λem: 535 एनएम) एफएएम फ्लोरोफोर के लिए निर्धारित किए गए हैं।
    6. फ्लोरोसेंट माप डेटा का विश्लेषण करने के लिए, https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic पर उपलब्ध एंजाइम कैनेटीक्स विश्लेषण के लिए पायथन ( सामग्री की तालिकादेखें) पैकेज का उपयोग करें। यह स्क्रिप्ट पहले 8-10 प्रारंभिक समय बिंदुओं के रैखिक फिट के ढलान का उपयोग करके प्रारंभिक प्रतिक्रिया वेग (वी0) की गणना करती है।

2. सेंसर निर्माण और लक्षण वर्णन

  1. डीएनए और प्रोटीज-सक्रिय पेप्टाइड (पीएपी) के संयुग्म को संश्लेषित करें।
    1. 3'-डीबीसीओ समूह (1.1 ईक्यू, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 20-मेर फॉस्फोरोथियोएटेड डीएनए संवाददाताओं को 100 एमएम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.0) में सी-टर्मिनस सिस्टीन अंत के साथ एजाइड-टर्मिनेटेड पीएपी के साथ >4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। यदि रात भर छोड़ रहे हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. बायोमोलेक्यूल्स के लिए आदर्श कॉलम से लैस उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली पर उत्पाद को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एचपीएलसी ढाल को 5% ए बफर (एच2ओ में 0.05% टीएफए) से शुरू करने के लिए सेट करें, 20 मिनट के लिए आइसोक्रेटिक रखें, और 0.3 एमएल मिनट -1 की प्रवाह दर के साथ 65 मिनट में 80% बी बफर (0.05% टीएफए, 99.95% एसीटोनिट्राइल) तक पहुंचें, और ~ 31 मिनट पर प्रतिधारण समय के साथ संयुग्म उत्पाद एकत्र करें।
    3. मैट्रिक्स14 के रूप में α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड का उपयोग कर मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर desorption/ionization-समय उड़ान (MALDI-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा शुद्ध संयुग्म मान्य ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. डीएनए-एन्कोडेड गतिविधि-आधारित नैनोसेंसर को संश्लेषित करें।
    1. 100 एमएम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.0) के 1 एमएल में मैलेमाइड-प्रतिक्रियाशील समूह के साथ बहुसंयोजक खूंटी (40 केडीए, 8-बांह, सामग्री की तालिकादेखें) के 2 मिलीग्राम भंग करें और फिल्टर (कटऑफ: 0.2 माइक्रोन)।
    2. खूंटी में सिस्टीन-समाप्त डीएनए-पेप्टाइड संयुग्म (2 ईक्यू, सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें और >4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करें। यदि रात भर छोड़ रहे हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेक्सट्रान-एगरोज समग्र मैट्रिक्स कॉलम के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके असंगत सामग्री निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें)। पीबीएस में नमूने चलाएं और डीएनए के लिए 260 एनएम और पेप्टाइड के लिए 280 एनएम पर अवशोषण की निगरानी करें।
    4. निर्माता की अनुशंसित गति ( सामग्री की तालिकादेखें) के अनुसार केन्द्रापसारक फिल्टर ट्यूबों (MWCO = 10 kDa) के साथ संश्लेषित नैनोसेंसर को केंद्रित करें।
    5. ssDNA परख किट ( सामग्री की तालिकादेखें) और λपूर्व पर एक प्लेट रीडर का उपयोग कर डीएनए की एकाग्रता योंमाणित: 485 एनएम और λ em: 535 एनएम. नैनोसेंसर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. डीएनए-एन्कोडेड गतिविधि-आधारित नैनोसेंसर की विशेषता बताएं।
    1. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) द्वारा डीएनए-एन्कोडेड नैनोसेंसर के हाइड्रोडायनामिक कण आकार को मापें।
      नोट: नैनोसेंसर की अपेक्षित आकार सीमा 15-50 एनएम है, जिसका औसत आकार 20-30 एनएम है। यदि एक सीमित आकार सीमा वांछित है, तो एफपीएलसी (चरण 2.3 में) का उपयोग विभिन्न आणविक भार के साथ संकरे अंशों को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
    2. केन्द्रापसारक फिल्टर ट्यूबों (MWCO = 10 केडीए) के साथ नैनोसेंसर को 0.5 मिलीग्राम/एमएल (डीएनए एकाग्रता द्वारा) पर केंद्रित करें और नमूनों को क्रायोहोल्डर पर घुड़सवार कार्बन फिल्म-लेपित तांबा ग्रिड पर लोड करें। क्रायोजेनिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (200 केवी, 10,000-60,000 का आवर्धन)14का उपयोग करके आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।

3. सेंसर इंजेक्शन और मूत्र संग्रह

  1. आधारभूत माप के लिए मूत्र ले लीजिए।
    1. माउस को एक कस्टम हाउसिंग चैंबर में रखें ( पूरक चित्र 1 देखें) आधार के रूप में 96-अच्छी प्लेट के साथ।
    2. माउस को नियंत्रित करें और प्लेट पर किसी भी शेष मूत्र को शून्य करने के लिए मूत्राशय पर कोमल दबाव लागू करें।
    3. सामान्य आवास के लिए माउस की जगह के बाद एक 1.5 एमएल ट्यूब में 96 अच्छी तरह से थाली से एकत्रित मूत्र (~ 100-200 माइक्रोन) पिपेट.
  2. प्रीक्लिनिकल म्यूरिन ट्यूमर मॉडल स्थापित करें।
    1. लूसिफ़ेरेज़-व्यक्त MC26-Fluc सेल लाइन (100k कोशिकाओं/माउस) के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा 6 से 8 सप्ताह पुरानी BALB/c महिला चूहों को टीका लगाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)। मॉनिटर ट्यूमर प्रगति साप्ताहिक एक विवो प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली में का उपयोग कर.
      नोट: ल्यूमिनसेंट सिग्नल द्वारा इंगित दृश्यमान ट्यूमर बोझ इस विशेष सेल लाइन के इंजेक्शन के सप्ताह 2 में लगभग होता है। ध्यान से एक नियमित आधार पर ट्यूमर प्रगति के दौरान ट्यूमर असर जानवरों पर जाँच करें.
  3. ट्यूमर आरोपण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर nanosensors इंजेक्षन.
    1. बाँझ पीबीएस में डीएनए बारकोड द्वारा 1 एनएमओएल की एकाग्रता पर नैनोसेंसर युक्त एक इंजेक्शन समाधान (200 माइक्रोन अधिकतम मात्रा) तैयार करें।
    2. पीबीएस में 200 माइक्रोन सेंसर समाधान को प्रत्येक प्रयोगात्मक माउस में अंतःशिरा में इंजेक्ट करें।
  4. चरण 1.1-1.3 में वर्णित सेंसर इंजेक्शन के बाद 1 घंटे में स्वस्थ नियंत्रण और ट्यूमर असर चूहों से मूत्र के नमूने एकत्र करें।
    नोट: ताजा मूत्र के नमूनों को सीधे डीएनए बारकोड विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है या बर्फ पर तुरंत जमे हुए किया जा सकता है।

4. डीएनए बारकोड का सीआरआईएसपीआर का पता लगाना: प्रतिदीप्ति आधारित

  1. ताजा मूत्र के नमूनों का उपयोग करें या बर्फ पर जमे हुए नमूनों को डीफ्रॉस्ट करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र मूत्र के नमूने।
  2. पूरक तालिका 2 में अभिकर्मकों को मिलाएं, कैस 12 ए एंजाइम (सामग्री की तालिकादेखें) को अंतिम रूप से जोड़ें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके प्रतिक्रिया मिलाएं। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  3. रिपोर्टर प्रतिक्रिया चलाएँ, जैसा कि पूरक तालिका 3 में दिखाया गया है, चरण 2 के उत्पाद का उपयोग करके तीन प्रतियों में। पिछले चरण 2 से प्रतिक्रिया जोड़ें और जल्दी से थाली पाठक को लाने के लिए.
  4. डीएनए रिपोर्टर के दरार कैनेटीक्स की निगरानी के लिए 3 घंटे (λपूर्व: 485 एनएम और λem: 535 एनएम) के लिए हर 2 मिनट में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट रीडर के साथ प्रतिदीप्ति को मापकर एलबीएकैस 12 ए सक्रियण का पता लगाएं।
  5. फ्लोरोसेंट माप डेटा का विश्लेषण करने के लिए, https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic पर उपलब्ध एंजाइम कैनेटीक्स विश्लेषण के लिए पायथन पैकेज का उपयोग करें। यह स्क्रिप्ट पहले 8-10 प्रारंभिक समय बिंदुओं के रैखिक फिट के ढलान का उपयोग करके प्रारंभिक प्रतिक्रिया वेग (वी0) की गणना करती है।

5. डीएनए बारकोड का सीआरआईएसपीआर का पता लगाना: कागज आधारित

  1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र मूत्र के नमूने।
    नोट: समानांतर में प्रतिदीप्ति आधारित और कागज आधारित सीआरआईएसपीआर का पता लगाने के लिए मूत्र के नमूने चलाएं।
  2. पूरक तालिका 2 में अभिकर्मकों को मिलाएं। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    नोट: यह इनक्यूबेशन कदम प्रतिदीप्ति आधारित सीआरआईएसपीआर का पता लगाने के लिए समान है।
  3. एक कागज पट्टी पर पार्श्व प्रवाह परख के लिए एफएएम-बायोटिन लेबल डीएनए रिपोर्टर का उपयोग कर रिपोर्टर प्रतिक्रिया चलाएँ ( सामग्री की तालिकादेखें). चरण 2 के उत्पाद का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से प्लेट में पूरक तालिका 4 में अभिकर्मकों को मिलाएं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऊपर वर्णित प्रतिदीप्ति आधारित सीआरआईएसपीआर पहचान परख में वास्तविक समय कैनेटीक्स निगरानी के अनुसार इष्टतम इनक्यूबेशन समय का चयन करें।
  4. एक 96 अच्छी तरह से थाली की एक ताजा अच्छी तरह से करने के लिए, पीबीएस के 80 माइक्रोन जोड़ें. इस अच्छी तरह से करने के लिए कदम 3 से नमूना के 20 माइक्रोन जोड़ें.
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से एक पार्श्व प्रवाह कागज पट्टी प्लेस और जब तक तरल पट्टी (<5 मिनट) के शीर्ष तक पहुँच इंतजार. कागज पट्टी पर नियंत्रण और / या नमूना बैंड (ओं) की उपस्थिति के लिए देखो.
  6. पार्श्व प्रवाह पट्टी की एक तस्वीर ले लो और ImageJ का उपयोग बैंड तीव्रता यों है.

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Representative Results

प्रोटीज़-सक्रिय पेप्टाइड सब्सट्रेट को नामांकित करना
सेंसर डिजाइन करने के लिए जो ऊतक की प्रोटियोलिटिक गतिविधि में परिवर्तन को प्रतिबिंबित करेगा, ऊतक में प्रोटीज गतिविधि को पहले पेप्टाइड जांच13 (चित्रा 1)की एक लाइब्रेरी का उपयोग करके विशेषता है। ताजा और जमे हुए ऊतक के नमूने सब्सट्रेट दरार का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किए गए झल्लाहट जांच के साथ ऊतक के नमूनों के संयोजन से ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की प्रोटियोलिटिक गतिविधि के बारे में पर्याप्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं। एक परिवार फ्लोरोफोर और एक CPQ-2 क्वेंचर के साथ झल्लाहट जांच की एक लाइब्रेरी ऊतक के नमूनों के साथ ऊष्मायन है। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा जाने वाला शम ऊतक और ट्यूमर ऊतक के बीच दरार दर में सबसे बड़ा अंतर के साथ जांच, इन विवो नैनोसेंसर(चित्रा 1ए)में उपयोग के लिए पेप्टाइड लिंकर्स के रूप में चुना जाता है। ट्यूमर पर्यावरण के शरीर विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने और गतिविधि प्रोफाइल के लिए प्रोटीज अभिव्यक्ति प्रोफाइल की प्रभावी ढंग से तुलना करने के लिए, झल्लाहट जांच को विशिष्ट प्रोटीज गतिविधि के साथ सब्सट्रेट दरार को जोड़ने के लिए पुनः संयोजक प्रोटीज के साथ इनक्यूबेट किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 1बी में दो उदाहरण जांच के साथ दिखाया गया है।

सेंसर निर्माण और लक्षण वर्णन
नैनोसेंसर एक बहुलक कोर, पेप्टाइड्स और एकल-फंसे डीएनए बारकोड से बने होते हैं, जैसा कि चित्र 2 ए में दर्शाया गया है। बहुलक कोर 40 केडीए, पीईजी डेंड्रिमर हैं जो 8 पेप्टाइड-डीएनए संयुग्म(चित्रा 2बी)के लिए वाहक के रूप में कार्य करते हैं। पेप्टाइड्स, ~ 1.4 केडीए, कोर और डीएनए को एक एमिनो एसिड अनुक्रम से जोड़ते हैं जिसे प्रोटियोलिटिक गतिविधि के माध्यम से क्लीव करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एकल-फंसे डीएनए बारकोड लंबाई में 20 बेस जोड़े, ~ 6.8 केडीए है, और विवो में बेहतर स्थिरता के लिए रासायनिक रूप से संशोधित है। संयुग्मन के बाद, पेप्टाइड-डीएनए निर्माण को एचपीएलसी के माध्यम से शुद्ध किया जाता है, जिससे संयुग्मित और मुक्त घटकों(चित्रा 2सी)को अलग करने की अनुमति मिलती है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण इंगित करता है कि संयुग्म का आणविक भार 8.283 केडीए है, जो क्रमशः 1.4 केडीए और 6.8 केडीए के पेप्टाइड और डीएनए बारकोड के लिए घटक आणविक भार दिए जाने की उम्मीद है। पेप्टाइड-डीएनए संयुग्म को आगे खूंटी डेंड्रिमर से जोड़ा जाता है। परिणामी सेंसर को मुक्त पेप्टाइड-डीएनए को हटाने के लिए एफपीएलसी का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है जो पीईजीलेटेड वाले(चित्रा 2डी)की तुलना में लंबे समय तक प्रतिधारण समय प्रदर्शित करता है। सेंसर के आकार को गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन और क्रायोजेनिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विशेषता दी जा सकती है, जो ~ 8 एनएम से ~ 20 एनएम (चित्रा 2 बी) तक कोर के पेप्टाइड-डीएनए के अलावा व्यास में वृद्धि का संकेत देती है। कण आकार में भिन्नता घटक श्रृंखलाओं के लचीलेपन और प्रत्येक खूंटी डेंड्रिमर के लिए संयुग्मित पेप्टाइड-डीएनए हथियारों की एक चर संख्या के कारण हो सकती है।

प्रीक्लिनिकल murine रोग मॉडल
सेंसर का परीक्षण करने के लिए विवो काम में बीएएलबी / सी चूहों के फेफड़ों में 3 सप्ताह के लिए ट्यूमर स्थापित करना, नैनोसेंसर को इंजेक्ट करना और सेंसर इंजेक्शन (चित्रा 3ए) के बाद मूत्र 1 घंटे इकट्ठा करना शामिल है। रोग प्रेरण के बाद नमूनों के साथ तुलना करने के लिए ट्यूमर टीकाकरण से पहले एक आधारभूत मूत्र का नमूना भी लिया जाता है। दुर्दमता का पता लगाने में सेंसर की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, लूसिफ़ेरेज़-एक्सप्रेशन कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन MC26 (MC26-Fluc) को अंतःशिरा में इंजेक्ट किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप विवो ल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में दिखाई देने वाले फेफड़े के ट्यूमर नोड्यूल होते हैं। हेमटोक्सिलिन और ईोसिनधुंधला 13 क्रमशः ट्यूमर-असर और शम नियंत्रण चूहों से फेफड़े के ऊतकों के हिस्टोपैथोलॉजी का पता चलता है, और 11- और 21-दिन के बाद इंजेक्शन पर ट्यूमर गठन के सबूत हैं, जैसा कि चित्रा 3 बी में काले तीर द्वारा इंगित किया गया है।

रासायनिक रूप से स्थिर डीएनए द्वारा सीआरआईएसपीआर सक्रियण
ssDNA बारकोड और पूरक crRNA युग्मन के माध्यम से Cas12a सक्रियण को अनुकूलित करने के लिए, विभिन्न ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों और लंबाई का परीक्षण किया गया है। Cas12a के सक्रियण का मूल्यांकन समय के साथ प्रतिदीप्ति में वृद्धि को मापने के द्वारा किया जाता है, जो एक झल्लाहट जोड़ी के साथ बाईस्टैंडर डीएनए रिपोर्टर के Cas12a दरार के कारण होता है। दरार दर में वृद्धि रासायनिक रूप से संशोधित एसएसडीएनए बारकोड की उच्च सांद्रता से जुड़ी है, जैसा कि एक प्रतिनिधि सीआरएनए/बारकोड जोड़ी(चित्रा 4बी)के साथ दिखाया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, एकाग्रता और सक्रियण के बीच एक रैखिक संबंध, जैसा कि चित्रा 4 बी में प्रदर्शित किया गया है, रीडआउट को मूत्र में डीएनए बारकोड उपस्थिति के प्रतिबिंबित करने और अप्रत्यक्ष रूप से विवो में प्रोटियोलिटिक गतिविधि को प्रतिबिंबित करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, पूरक तालिका 1 में विस्तृत के रूप में कई अलग सीआरएनए अनुक्रमों, कैस 12 ए सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो बहुसंकेतन को सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है. डीएनए सक्रियकर्ताओं परख प्रदर्शन में उनकी समानता के आधार पर विवो सेंसर में के निर्माण के लिए चुना गया है. रासायनिक रूप से संशोधित एसएसडीएनए जो सिंथेटिक बायोमार्कर की विवो स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है, ने अनमॉडिफाइड डीएसडीएनए और एसएसडीएनए(चित्रा 4सी)की तुलना में कैस12ए सक्रियण का प्रदर्शन किया।

रासायनिक रूप से स्थिर डीएनए बारकोड का मल्टीप्लेक्स मूत्र पता लगाना
एकाधिक सीआरएनए-संशोधित एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) उत्प्रेरक जोड़े को विभिन्न अनुक्रमों के बीच उनकी ऑर्थोगोनैलिटी के लिए सत्यापित किया गया है। यह चित्रा 5 ए में दर्शाया गया है, के रूप में कई अच्छी तरह से assays में एक साथ readout के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, असंसाधित मूत्र में संशोधित डीएनए अणुओं को पार्श्व-प्रवाह पेपर स्ट्रिप्स पर वर्णमिति रीडआउट का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 5बी में दिखाया गया है। अग्रणी 'नमूना बैंड' की उपस्थिति Cas12a मूत्र डीएनए द्वारा ट्रिगर होने के बाद रिपोर्टर दरार के माध्यम से पता लगाने योग्य परिवार की रिहाई को इंगित करता है। जब Cas12a माउस मूत्र में डीएनए उत्प्रेरक द्वारा सक्रिय होता है, तो यह फ्लोरेसिन (FAM) -बायोटिन-युग्मित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड रिपोर्टर को साफ करता है, FAM अणु को जारी करता है, जो तब 'नमूना बैंड' पर पता लगाने योग्य होता है। स्ट्रेप्टाविडिन के लिए बायोटिन के बंधन के कारण चाचा संवाददाताओं को 'नियंत्रण बैंड' पर कब्जा कर लिया जाता है। नैनोसेंसर को विवो प्रयोगों के लिए चुना जाता है और प्रोटीज़-एक्टिवेबल पेप्टाइड्स और अलग-अलग डीएनए बारकोड का उपयोग करके बनाया जाता है। पेप्टाइड्स पूर्व विवो ऊतक प्रोफाइलिंग(चित्रा 1ए)के माध्यम से नामांकित हैं और डीएनए बारकोड समान कैस12एए(चित्रा 4बी)के आधार पर चुने गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सेंसर निर्माण के लिए कोलोरेक्टल कैंसर में अनियमित प्रोटीज द्वारा सक्रिय पेप्टाइड सब्सट्रेट की पहचान। (ए) झल्लाहट युग्मित पेप्टाइड सब्सट्रेट, प्रत्येक में एक एफएएम फ्लोरोफोर और एक सीपीक्यू -2 क्वेंचर द्वारा फ्लैंक किए गए पेप्टाइड अनुक्रम से मिलकर, पुनः संयोजक प्रोटियोलिटिक एंजाइम या ऊतक समरूप के खिलाफ जांच की जाती है। (बी)झल्लाहट युग्मित पेप्टाइड सब्सट्रेट (जांच 1 और 2) के प्रतिनिधि प्रोटीज दरार कैनेटीक्स। यह आंकड़ा हाओ एट अल.13 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक बहुलक खूंटी कोर के साथ डीएनए-बारकोडेड गतिविधि-आधारित नैनोसेंसर की विशेषता। (ए) डीएनए-बारकोडेड नैनोसेंसर में पॉलीमेरिक नैनोकैरियर (8-आर्म पीईजी) शामिल है जो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ बारकोडेड प्रोटीज-सक्रिय पेप्टाइड्स के साथ कार्यात्मक है। (बी) गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण 8.3 एनएम (केवल खूंटी कोर) और 13 एनएम (कार्यात्मक सेंसर) से कण आकार में वृद्धि दर्शाता है। (सी) पेप्टाइड-डीएनए संयुग्म का एचपीएलसी शुद्धिकरण। संयुग्म का विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री में किया जाता है और अपेक्षित आणविक भार दिखाता है। (घ) संवेदक का एफपीएलसी शुद्धिकरण कार्यात्मक संवेदक और असीमित पेप्टाइड-डीएनए संयुग्म के पृथक्करण को दर्शाता है। यह आंकड़ा हाओ एट अल.13 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विवो रोग प्रेरण और सेंसर उपयोग में। (ए) ट्यूमर के विकास पर अलग-अलग समय बिंदुओं पर नैनोसेंसर के साथ अनुदैर्ध्य ट्यूमर निगरानी की समयरेखा। (बी)ट्यूमर टीकाकरण और खारा-इंजेक्शन शाम नियंत्रण चूहों के बाद 11- और 21 दिनों में सीआरसी फेफड़े के ट्यूमर वाले बीएएलबी/सी चूहों के हिस्टोलॉजिकल फेफड़े का धुंधलापन। स्केल बार = 200 माइक्रोन. अंगों को तय किया गया था, पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था, और हेमटोक्सिलिन और ईोसिन के साथ दाग दिया गया था। अध्ययन समय बिंदु प्रति एन = 3 चूहों के साथ किया गया था और एक प्रतिनिधि जानवर से छवियों को दिखाया गया है। तीर फेफड़ों में ट्यूमर नोड्यूल का संकेत देते हैं। यह आंकड़ा हाओ एट अल.13 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: रासायनिक रूप से स्थिर डीएनए सक्रियकर्ताओं द्वारा Cas12a सक्रियण। (ए) पूरक सीआरएनए के साथ बंधन के माध्यम से एक प्रतिनिधि एसएसडीएनए बारकोड द्वारा कैस 12 ए का सक्रियण खुराक पर निर्भर तरीके से बाईस्टैंडर डीएनए के ट्रांस-दरार में परिणाम देता है, जैसा कि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा मापा जाता है। (बी) प्रारंभिक प्रतिक्रिया वेग (वी0) (ए) में एक प्रतिक्रिया की शुरुआत में वक्र के ढलान से निर्धारित किया जाता है और परख प्रदर्शन की रैखिक सीमा निर्धारित करने के लिए प्लॉट किया जाता है। (सी) डबल-स्ट्रैंडेड, सिंगल-स्ट्रैंडेड और रासायनिक रूप से संशोधित डीएनए एक्टिवेटर द्वारा कैस 12 ए सक्रियण। यह आंकड़ा हाओ एट अल.13 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मल्टीप्लेक्स सीआरआईएसपीआर-कैस 12-मध्यस्थता डीएनए बारकोड दो पहचान विकल्पों के साथ रीडआउट। (ए) विभिन्न संशोधित एसएसडीएनए एक्टिवेटर-सीआरआरएनए जोड़े के सक्रियण पर कैस 12 ए की ट्रांस-दरार दरों को कैस 12 ए फ्लोरोसेंट दरार परख में निर्धारित किया जाता है। i.v. प्रशासन के 1 घंटे के बाद संशोधित ssDNA एक्टिवेटर के 1 nmol के साथ इंजेक्शन चूहों से एकत्र मूत्र के नमूनों के साथ assays किया जाता है। यह आंकड़ा हाओ एट अल.13 से अनुकूलित है। (बी) पेपर स्ट्रिप के विभिन्न स्थानों पर वर्णमिति परिवर्तनों के साथ मूत्र नमूना-सक्रिय कैस 12 ए का पेपर रीडआउट दिखाई देता है। शीर्ष बैंड क्लीव्ड एफएएम डीएनए रिपोर्टर से है और निचला बैंड चाचावादे एफएएम-बायोटिन रिपोर्टर से है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: मूत्र संग्रह कक्ष एक 96 अच्छी तरह से थाली से अधिक जगह करने के लिए. माउस अस्थायी रूप से 96 अच्छी तरह से थाली में पेशाब के लिए सिलेंडर के अंदर रखा गया है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: सेंसर फॉर्मूलेशन और सीआरआईएसपीआर परख के लिए ओलिगो और पेप्टाइड अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: प्रतिदीप्ति आधारित और कागज आधारित Cas12a और मूत्र नमूना प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मकों. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 3: प्रतिदीप्ति आधारित सीआरआईएसपीआर का पता लगाने के लिए रिपोर्टर प्रतिक्रिया के अभिकर्मक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 4: कागज आधारित सीआरआईएसपीआर का पता लगाने के लिए रिपोर्टर प्रतिक्रिया के अभिकर्मक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत एक पोर्टेबल मूत्र परीक्षण के साथ मल्टीप्लेक्स कैंसर का पता लगाने के लिए एक उच्च अनुकूलन योग्य मंच है जो न्यूनतम इनवेसिव इंजेक्शन सेंसर का उपयोग करके रोग से जुड़े प्रोटियोलिटिक गतिविधि का आकलन करता है। ट्यूमर प्रोटीज द्वारा सक्रिय होने पर, पेप्टाइड सब्सट्रेट दरार को मूत्र में डीएनए बारकोड रिलीज के माध्यम से बढ़ाया जाता है। मूत्र के नमूने में सिंथेटिक डीएनए रिपोर्टरों को फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन या एक साधारण पेपर-आधारित परीक्षण का उपयोग करके एक माध्यमिक सीआरआईएसपीआर-कैस-मध्यस्थता एंजाइमेटिक प्रवर्धन द्वारा पढ़ा जा सकता है। डीएनए बारकोडिंग मल्टीप्लेक्सिटी को वहन करने के लिए सिंथेटिक बायोमार्कर को लेबल करने के लिए एक आकर्षक तरीका है। रासायनिक संशोधन के माध्यम से डीएनए बारकोड की स्थिरता में सुधार विवो में नैनोसेंसर स्थिरता बनाए रखने के लिए अनिवार्य है। विशेष रूप से, CRISPR-Cas12a के माध्यम से डीएनए बारकोड का पता लगाने को स्थिर रीढ़ के साथ पूरी तरह से फॉस्फोरोथियोएट-संशोधित डीएनए बारकोड का उपयोग करके सक्रिय किया जा सकता है। रासायनिक संशोधन अपने मूल डीएनए समकक्ष के सापेक्ष CRISPR-Cas12a सक्रियण की गति को कम करता है, हालांकि, इसकी बढ़ी हुई स्थिरता के कारण। इसके अलावा, सीआरएनए में टर्मिनल संशोधनों को सम्मिलित करना या डीएनए बारकोड में विभिन्न संशोधित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का परीक्षण करना सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता डीएनए बारकोड डिटेक्शन15 की संवेदनशीलता को और बढ़ा सकता है, जिससे कैंसर निदान की पहचान (एलओडी) की सीमा में सुधार हो सकता है।

आणविक प्रवर्धन के अलावा, प्रारंभिक कैंसर का पता लगाने के लिए आवश्यक एलओडी प्राप्त करने के लिए एक और महत्वपूर्ण रणनीति में मूत्र में सिंथेटिक डीएनए संवाददाताओं को केंद्रित करने के लिए गुर्दे द्वारा आकार निस्पंदन का लाभ उठाना शामिल है। यह अंत करने के लिए, डीएनए बारकोड के आकार का अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है। 20-mer crRNA-पूरक डीएनए ने मूत्र के नमूनों से इष्टतम CRISPR-Cas12a-मध्यस्थता डीएनए बारकोड रीडआउट का प्रदर्शन किया। विभिन्न सीआरआईएसपीआर न्यूक्लिएज या प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल पर लागू होने पर यह इष्टतम लंबाई भिन्न हो सकती है।

इस पहचान प्रणाली की प्रजनन क्षमता को बनाए रखने के लिए, बैच-टू-बैच भिन्नता को कम करने के लिए इंजेक्शन योग्य नैनोसेंसर का गहन लक्षण वर्णन करना महत्वपूर्ण है। प्रति कोर पेप्टाइड-डीएनए संयुग्मों की संख्या में भिन्नता मूत्र में जारी डीएनए बारकोड की मात्रा को बदल देगी और इसलिए अंतिम रीडआउट को प्रभावित करेगी। इसी तरह, अंतःशिरा में सेंसर का सावधानीपूर्वक इंजेक्शन सेंसर खुराक में स्थिरता में मदद करेगा। एक निश्चित समय बिंदु पर प्रत्येक जानवर से मूत्र की मात्रा के कम से कम 50 माइक्रोन के उचित मूत्र संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए, ट्यूमर असर पशु जलयोजन को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यह गैर गीला पानी जेल पर चूहों रखने या मूत्र संग्रह16 से पहले एक घंटे चमड़े के नीचे पीबीएस इंजेक्शन द्वारा समर्थित किया जा सकता है.

मूत्र संग्रह का समय और सीआरआईएसपीआर-कैस-मध्यस्थता डीएनए बारकोड रीडआउट की अवधि परख स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। परिसंचरण में बारकोड अंतःशिरा इंजेक्शन और रक्त से आकार पर निर्भर गुर्दे निस्पंदन के बाद विशेषता एकल घातीय एकाग्रता क्षय से गुजरना, माउस मॉडल13 में प्रशासन के बाद 1 घंटे पीकिंग. यह समय बिंदु एक अलग पशु मॉडल में भिन्न हो सकता है। सीआरआईएसपीआर-कैस सक्रियण परख (फ्लोरोसेंट बनाम पेपर-आधारित पार्श्व प्रवाह परख) के दो रीडआउट प्रारूपों के लिए, सीआरआईएसपीआर-कैस दरार उत्पाद को पढ़ने के लिए इष्टतम अंत-बिंदु की अनुमति देते हुए, पार्श्व प्रवाह से पहले प्रतिदीप्ति आधारित कैनेटीक्स को ट्रैक करना महत्वपूर्ण है।

प्रोटियोलिटिक और सीआरआईएसपीआर-कैस-मध्यस्थता एंजाइमेटिक सक्रियण से दोहरे सिग्नल प्रवर्धन चरणों के समावेश और रोग की जटिलता को पकड़ने के लिए मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता के कारण यह दृष्टिकोण फायदेमंद है। सेंसर की मल्टीप्लेक्सिटी का विस्तार करने के लिए सावधानीपूर्वक सामग्री खुराक की आवश्यकता होगी और साथ ही पोर्टेबिलिटी और उपयोग में आसानी बनाए रखने के लिए रीडआउट के थ्रूपुट का विस्तार करना होगा। इस रणनीति के लिए कई मॉडलों में प्रोटीज गतिविधि के गहन लक्षण वर्णन और किसी विशेष बीमारी, या रोग चरण की ओर प्रोटियोलिटिक प्रोफ़ाइल की विशिष्टता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, जबकि सेंसर इंजेक्शन बायोप्सी जैसे कई नैदानिक विकल्पों की तुलना में कम आक्रामक है, अंतःशिरा इंजेक्शन सेंसर प्रशासन के लिए प्रशिक्षित फ्लेबोटोमिस्ट पर भरोसा कर सकता है, संभावित रूप से नैदानिक सेटिंग में प्रारंभिक पहचान के बजाय रोग की निगरानी के लिए उपयोग के मामले को सीमित कर सकता है। प्रणालीगत इंजेक्शन के अलावा, डीएनए-बारकोडेड नैनोसेंसर को आगे योगों के साथ इंजीनियर किया जा सकता है जिन्हें पोर्टेबल बीमारी का पता लगाने और रोग की प्रगति और चिकित्सा मूल्यांकन की आसान आत्म-निगरानी की अनुमति देने के लिए गैर-मौखिक मौखिक, साँस और सामयिक वितरण के माध्यम से लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

S.N.B., L.H., और R.T.Z. को इस कार्य की सामग्री से संबंधित पेटेंट आवेदन पर आविष्कारकों के रूप में सूचीबद्ध किया गया है। एसएनबी ग्लाइम्पसे बायो, सैटेलाइट बायो, लिसाटा थेरेप्यूटिक्स, पोर्ट थेरेप्यूटिक्स, इंटरगैलेक्टिक थेरेप्यूटिक्स, मैट्रिसोम बायो में इक्विटी रखता है, और वर्टेक्स में निदेशक है; मॉडर्ना के लिए परामर्श करता है, और Johnson & Johnson, Revitope, और Owlstone से प्रायोजित अनुसंधान निधि प्राप्त करता है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (स्वानसन बायोटेक्नोलॉजी सेंटर) से कोच इंस्टीट्यूट सपोर्ट ग्रांट नंबर P30-CA14051 द्वारा समर्थित किया गया था, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरनमेंटल हेल्थ साइंसेज से एक कोर सेंटर ग्रांट P30-ES002109, कोच इंस्टीट्यूट के मार्बल सेंटर फॉर कैंसर नैनोमेडिसिन, कैथी और कर्ट मार्बल कैंसर रिसर्च फंड के माध्यम से कोच इंस्टीट्यूट फ्रंटियर रिसर्च प्रोग्राम, और कैंसर अनुसंधान के लिए वर्जीनिया और डीके लुडविग फंड। A.E.V.H. एक NIH- वित्त पोषित प्रीडॉक्टोरल ट्रेनिंग फेलोशिप (T32GM130546) द्वारा समर्थित है। एसएनबी एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है। L.H. को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से K99/R00 पाथवे टू इंडिपेंडेंस अवार्ड और बोस्टन विश्वविद्यालय से स्टार्टअप फंडिंग द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x NEB Buffer 2.1 New England Biolabs B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group IDT Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column  Agilent HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) GE Healthcare FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) EMD millipore Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine CPC Scientific Custom peptide
crRNAs  IDT See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy JEM-2100F JEOL cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates CPC Scientific Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS) DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM New England Biolabs M0653T
Experimental animals Taconic Biosciences BALB/cAnNTac 6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit Miltenyi Biotec MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry  Bruker Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group JenKem A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9 https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent Invitrogen O11492 ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates IDT Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column GE Healthcare GE28-9909-44 For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225

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References

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Van Heest, A. E., Deng, F., Zhao, R. … More

Van Heest, A. E., Deng, F., Zhao, R. T., Harzallah, N. S., Fleming, H. E., Bhatia, S. N., Hao, L. CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics. J. Vis. Exp. (202), e66189, doi:10.3791/66189 (2023).

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