Summary
Fundamenteel, maar toch unieke eigenschappen van het knaagdieren olfactorisch systeem hebben ertoe geleid dat het toenemende onderzoek onder biologen. Een relatief eenvoudige beoordeling van de functie is dan ook noodzakelijk. Hier beschrijven we gevoelige tests voor de karakterisering van de muis olfactorische gevoeligheid en voorkeur.
Abstract
Het knaagdier olfactorisch systeem is van toenemend belang voor wetenschappers, studeerde, voor een deel, in de systeembiologie vanwege de stereotiepe, maar toch toegankelijk circuit. Daarnaast is dit gebied de unieke mogelijkheid om nieuwe neuronen te genereren gedurende de levensduur van een organisme maakt het een aantrekkelijk systeem voor de ontwikkelingsbiologie en regeneratieve biologen gelijk. Deze rente vereist een middel voor een snelle, maar betrouwbare beoordeling van olfactorische functie. Veel testen van olfactorische bekwaamheid zijn complex, variabel of niet speciaal voor muizen. Ook een aantal tests gevoelig zijn voor het geheugen tekorten en gebreken in de olfactorische vaardigheden, confounding verkregen resultaten.
We beschrijven hier een eenvoudige batterij van tests ontworpen om defecten in de olfactorische gevoeligheid en de voorkeur te identificeren. Eerste, een eerste algemene gezondheid evaluatie maakt de identificatie van dieren die geschikt zijn voor verdere testen. Ten tweede, zijn muizen blootgesteld aan verschillende verdunningen van geuren om na te gaan of er een drempel verschil. Ten derde, zijn muizen gepresenteerd met verschillende geuren, zowel aantrekkelijk en aversieve, die het mogelijk maken voor de beoordeling van olfactorische voorkeur. Deze eenvoudige onderzoeken moet de eerste karakterisering van olfactorische gedrag toegankelijk voor laboratoria van verschillende middelen en expertise.
Protocol
General Health Examen
Een meer uitgebreide behandeling van de algemene gezondheid examens kan worden gevonden in uitstekende gedrag fenotyperen Jacqueline Crawley's bron, Wat is er mis met mijn muis? 1. We hebben eerst gebruik van een aangepaste observationele testbatterij voor de algemene gezondheid van een persoon te beoordelen. De batterij bestaat uit items van uitgebreide evaluatie protocol Samuel Irwin's 2 tot en met snel te identificeren die onderwerpen die ongeschikt zal zijn voor verdere testen. In het kort, de aangepaste batterij identificeert dieren die fysiek afwijkend (bijv. ernstig onder-of overgewicht, slecht verzorgd, dyspneic) of dat vertonen abnormale houding, motoriek of gedrag. Deze kunnen allemaal uitingen van ziekte. Elke eerste evaluatie die op vergelijkbare wijze identificeert ongezond onderwerpen geschikt is.
Het is ook belangrijk op te merken dat de dieren op humane wijze worden zowel gebruikt worden tijdens de algemene gezondheid examen als tijdens de daaropvolgende tests. Geen anesthesie of analgesie wordt gebruikt als deze tests omvatten niet alle potentieel pijnlijke procedures.
Olfactorische gevoeligheid testen
Deze test is ontworpen om een verschil in olfactorische gevoeligheid tussen twee groepen muizen (bijv. een wild-type en een mutant groep dieren) op te sporen. In deze test worden meerdere verdunningen van een geur gemaakt. Een naïeve dier onderzoekt dan een enkele verdunning van deze geur en de totale verkennende tijd (binnen 3 minuten) is opgenomen. Meerdere verdunningen van de geur zijn getest op verschillende, naïeve onderwerpen en de totale verkennende tijd wordt gebruikt om de dosis respons curves voor elke groep van muizen te genereren. Twee onderzoekers moeten worden betrokken bij het testen, met een blind naar onderwerp genotypen en / of conditie.
Primaire onderzoeker
- Verkrijgen vier schone kooien (8 H x 10 B x 18 L, in inches), allemaal zonder beddengoed. Line-up van de vier kooien in de bioveiligheid kast.
- Stel scheidingswanden tussen de verschillende arena met behulp van ondoorzichtig papieren filter. Plaats een zwarte poster bestuur over de laatste partitie zodanig dat de zwarte kant lijnen aan de zijkant en onderkant van de kooi. Bedek de bovenkant van de arena met een duidelijk stuk plexiglas zodat het licht naar de arena te verlichten.
(A)
(B) 
Figuur 1. Arena Set-Up. (A) Goed gedrapeerd, lege arena (b) Arena met als onderwerp en geurende filtreerpapier. - Begin habituating de onderwerpen. Plaats het eerste onderwerp in de eerste kooi voor gewenning. Na 15 minuten, zet het eerste onderwerp in de tweede kooi. Reinig de eerste kooi met Quatricide TB. Plaats vervolgens de tweede onderwerp in de eerste, schoongemaakt kooi. Herhaal dit proces met de volgende onderwerpen. Uiteindelijk moet elk onderwerp worden gewend in alle drie de kooien voordat ze geplaatst in de arena (vierde en laatste kooi) voor nog eens 15 minuten van gewenning voor de test.
(B) 
Blind onderzoeker
- Maak een passend aantal van 2 inch met 2 inch pleinen van filtreerpapier voor geur monsters.
- Met behulp van de vooraf geselecteerde geur, de juiste verdunnen het. Voor hydrofobe monsters, zoals pindakaas, gebruik van olie als oplosmiddel, voor alle anderen, gebruik gedestilleerd water. Vortex.
- Stel een digitale video-opname-apparaat aan het andere eind van de bioveiligheid kabinet, dat de hele kooi einde is in focus. Neem een eerste video om ervoor te zorgen parameters toereikend zijn.
- Noteer de volgorde waarin de verdunningen wordt getest, en zorg ervoor dat de volgorde van de proeven willekeurig.
- Record onderwerp zwerfvuil en identificatienummers.
- Zodra het onderwerp is gewend gedurende 15 minuten in de arena, beginnen met de voorbereiding voor de eerste proef. Pipetteer de eerste verdunning op en neer in de conische buis voordat pipetteren deze op een filtreerpapier plein. Het papieren filter oppervlak moet optimaal worden ~ 85% bedekt (ongeveer 0,50 ml van oplossing). Gebruik een kimwipe te zorgen dat de filter papier is overdreven niet verzadigd.
- Begin met video-opname.
- Breng het filter plein in de kooi aan de andere kant van de huidige dier positie.
- Begin timing.
- Na 3 minuten, stopt de opname en verwijder de verdunde geur.
- Als er slechts een geur (bijv. kaneel) moet worden getest, verwijdert u de eerste proefpersoon uit de arena. Herhaal stap 6-11 voor elk dier, de juiste verdunning van de geur voor elk onderwerp. Als er meer dan een geur is te testen, maar doe de test onderwerp niet uit de arena. In plaats daarvan beginnen timing.
- Adequaat verdunnen de volgende geur met dezelfde methoden als hierboven vermeld.
- Na 1 minuut, begin video-opname. Breng het filter plein met de verdunning van de volgende geur in de kooi aan de andere kant van de huidige dier position.
- Herhaal stap 6-13 voor elke geur, wijzend op de videobestand nummer voor elke proef.
- Herhaal stap 6-14 voor elk onderwerp.
Figuur 2. Representatieve resultaten voor een sessie van olfactorische gevoeligheid testen. Elke muis van ofwel de controlegroep (groep A) of de experimentele groep (groep B) werd blootgesteld aan een van de vijf verschillende verdunningen van kaneel extract op filtreerpapier voor een, drie minuten durende sessie. Totale tijd besteed aan het verkennen van de filtreerpapier werd beoordeeld. Muizen in groep A hebben een grotere gevoeligheid reukzin dan die in groep B.
Olfactorische Voorkeur Testen
Deze test is ontwikkeld om specifieke detectie tekortkomingen, namelijk de mogelijkheid om aantrekkelijke of aversieve gevoel geuren te identificeren. De volgende procedure leent vrijelijk uit het protocol van Kobayakawa, K., et al.3. Nogmaals, twee onderzoekers worden betrokken bij het testen, met een blind naar onderwerp genotypen en / of conditie. De totale verkennende tijd is weer opgenomen (op video bekijken) voor verschillende geuren. Die geuren met een totale verkennende keer groter is dan water worden aangeduid als 'aantrekkelijk', terwijl mensen met een keer minder dan water worden "aversieve". De onderzoeker beschouwt dan of dezelfde geuren zijn "aantrekkelijke" of "aversieve" voor de verschillende proefpersonen.
Volg stappen 1-3 in de Olfactorische Gevoeligheid Testing Zone voor de primaire onderzoeker.
Blind Onderzoeker
De procedure voor de reukzin voorkeur testen is het zelfde, met lichte wijzigingen van stap 2 en 4. Volg de stappen 1 tot 15 in de olfactorische gevoeligheid testen afdeling blinde onderzoeker, met de volgende wijzigingen: Voor stap 2, het gebruik van de vooraf geselecteerde geuren (een combinatie van zowel aantrekkelijk en negatieve geuren), maken voldoende verdunde oplossingen van elke in conische buizen. Voor hydrofobe monsters, zoals pindakaas, gebruik van olie als oplosmiddel, voor alle anderen, gebruik gedestilleerd water. Vortex. Voor stap 4, in plaats van het opnemen van de verdunning te testen, registreren de volgorde van de verschillende geuren die zal worden getest, randomizing de volgorde van de proeven.
Deze test is ontwikkeld om specifieke detectie tekortkomingen, namelijk de mogelijkheid om aantrekkelijke of aversieve gevoel geuren te identificeren. De volgende procedure leent vrijelijk uit het protocol van Kobayakawa, K. et al.. 3. Nogmaals, twee onderzoekers worden betrokken bij het testen, met een blind naar onderwerp genotypen en / of conditie. De totale verkennende tijd is weer opgenomen (op video bekijken) voor verschillende geuren. Die geuren met een totale verkennende keer groter is dan water worden aangeduid als "aantrekkelijke", terwijl die met keer minder dan water worden "aversieve". De onderzoeker beschouwt dan of dezelfde geuren zijn "aantrekkelijke" of "aversieve" voor de verschillende proefpersonen.
Volg stappen 1-3 in de Olfactorische Gevoeligheid Testing Zone voor de primaire onderzoeker.
Blind Onderzoeker
De procedure voor de reukzin voorkeur testen is het zelfde, met lichte wijzigingen van de stappen 2, 4 en 13. Volg de stappen 1 tot 15 in de olfactorische gevoeligheid testen afdeling blinde onderzoeker, met de volgende wijzigingen: Voor stap 2, het gebruik van de vooraf geselecteerde geuren (een combinatie van zowel aantrekkelijk en negatieve geuren), maken voldoende verdunde oplossingen van elke in conische buizen. Voor hydrofobe monsters, zoals pindakaas, gebruik van olie als oplosmiddel, voor alle anderen, gebruik gedestilleerd water. Vortex. Voor stap 4, in plaats van het opnemen van de verdunning te testen, registreren de volgorde van de verschillende geuren die zal worden getest, randomizing de orde in elke proef. Voor stap 13, plaats het filtreerpapier plein met de volgende geur in het hok aan de andere kant van het huidige van het dier positie.
Figuur 3. Representatieve resultaten voor een sessie van olfactorische voorkeur testen. Elke muis werd blootgesteld aan elk van de verschillende geuren op filtreerpapier voor een, drie minuten durende sessie. Totale tijd besteed aan het verkennen van de filtreerpapier werd beoordeeld. Pindakaas en vanille zijn aantrekkelijk geuren (verkennend tijd geur> verkennend tijd water) en 2-Methylbutyric Acid is aversief (verkennend tijd geur <verkennend tijd water).
Scoren van de reuk Tests
Na het verkrijgen van alle olfactorische gevoeligheid en voorkeur video's, is het noodzakelijk om het analyseren van de totale tijd besteed aan het verkennen van elke verdunning / geur. Laat de blinde onderzoeker alle video's te analyseren op consistentie.
- Een voorbeeld van de VIDeo, en merkt het volgende: a) wanneer de filter papier wordt geplaatst in de arena, b) als de muis nadert het filtreerpapier, c) als de muis onderzoekt de filtreerpapier en d) als er drie minuten zijn verstreken (vanaf het moment dat het filter papier werd geplaatst in de arena). Weten wanneer te richten op het gedrag van de muis maakt het makkelijker om nauwkeurig de score van de totale tijd besteed aan het verkennen op herziening.
- Bekijk de video. Let op het moment dat de muis voor het eerst het filter papier (latency) onderzoekt.
- Met behulp van een stopwatch, tijd alle onderzoeken binnen drie minuten van het plaatsen van de filter papier in de arena. De tijd van onderzoek wordt gedefinieerd als een moment dat de muis zijn neusgaten <1 mm van het filtreerpapier. Het is belangrijk om niet op te nemen op een van de tijd dat de muis is in de nabijheid van het filter papier, maar is niet actief onderzoekt het. Neem geen aanvallen van kauwen en likken het papier of aanvallen van het zitten op het papier in de totale verkennende tijd. Het is noodzakelijk om de voet en consequent zich aan deze regels nauwkeurig te analyseren olfactorische gedrag.
- Record latentietijd, de totale tijd besteed aan onderzoek naar de filtreerpapier-en video-dossiernummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De genoemde testen zorgen voor de snelle en betrouwbare beoordeling van de elementaire olfactorische functie. Het is niet te vergeten, echter dat dit de betrouwbaarheid van de juiste selectie en de voorbereiding van onderwerpen voor het testen vereist. Dieren die ziek zijn of anderszins onbekwaam zijn vaak inconsistent proefpersonen. Ook gewenning van de proefpersonen is de sleutel. We hebben ontdekt dat het gebruik van meerdere kooien tijdens de gewenning proces maakt het mogelijk de dieren te worden comfortabel met experimentator behandeling en veranderende omgeving. We hebben ook ontdekt dat keer korter dan die welke voor gewenning niet voldoende zijn om angst te verminderen. Angstige dieren zijn ook vaak onvoorspelbaar proefpersonen en kan obscure echte verschillen.
Bij het eigenlijke testen van de muizen, is het belangrijk niet alleen consistent te zijn bij de verwerving van de gegevens, maar ook in het analyseren van de onderwerpen 'gedrag. We hebben gemerkt dat het nuttig om alleen tellen dat moment dat de proefpersoon de neus is <1 mm van de filter papier als onderdeel van de totale verkennende tijd. Ook zijn gedrag, zoals bijten of kauwen van de filter papier niet opgenomen in de totale verkennende tijd. Bovendien kan latentie tijd (voor aantrekkelijke geur), ook een nuttige maatstaf. Verschillende muizen achtergronden kunnen vereisen verschillende verdunningen van geuren voor effectieve discriminatie tussen een controle-en experimentele groep. Het is ook belangrijk om seks-match en leeftijd-match paren. We vonden het nuttig om empirisch afleiden juiste geur verdunningen (over onderwerpen die vergelijkbaar is met de controle groep) voordat u verder gaat met de experimentele testen van naïeve muizen. Ten slotte werden deze tests geselecteerd om de werking van andere cognitieve stoornissen, met name, gebreken in leer-en / of geheugen te minimaliseren. Te dien einde, is het essentieel om naïeve muizen te gebruiken voor het testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Financiering: Dit werk werd ondersteund door een Stuart HQ & Victoria Quan Predoctorale Fellowship (RMW), NIH Pioneer Award (RAS)
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
