Summary
יסוד, המאפיינים הייחודיים של המערכת עדיין מכרסם הריח הובילו מחקר הגוברת בקרב ביולוגים. הערכה פשוטה יחסית של תפקידה הוא צריך גם אז. כאן אנו מתארים בדיקות רגישות לאפיון של רגישות העכבר העדפה הריח ו.
Abstract
מערכת ההרחה היא מכרסם של הגדלת עניין למדענים, למד, בין השאר, בביולוגיה מערכות בגלל המעגלים סטריאוטיפית, נגיש עדיין שלה. בנוסף, יכולת ייחודית זו של האזור כדי לייצר נוירונים חדשים לאורך כל החיים של אורגניזם עושה את זה מערכת אטרקטיבי עבור ביולוגים התפתחותיים משובי כאחד. אינטרס כזה מחייב אמצעי להערכה מהירה, אך אמין של תפקוד חוש הריח. בדיקות רבות יכולת ההרחה הם מורכבים, משתנים או לא תוכנן במיוחד עבור עכברים. כמו כן, כמה בדיקות רגישים גירעונות זיכרון, כמו גם ליקויים ביכולות ההרחה, התוצאות שהושגו מבלבלים.
כאן אנו מתארים סוללה פשוטה של בדיקות שנועדו לזהות פגמים רגישות חוש הריח העדפה ו. ראשית, ההערכה הראשונית בריאות כללית מאפשרת זיהוי של בעלי חיים מתאים בדיקות נוספות. שנית, עכברים נחשפים דילולים שונים של ריחות על מנת לבדוק אם יש הבדל הסף. שלישית, עכברים מוצגים עם ריחות שונים, הן אטרקטיביות מרתיעה, אשר מאפשרים הערכה של העדפת חוש הריח. מחקרים אלה פשוט צריך לעשות את האפיון הראשוני של התנהגות הריח נגיש עבור מעבדות של משאבים מגוונים ומומחיות.
Protocol
כללי הבחינה הבריאות
טיפול מקיף יותר של בדיקות בריאות כללית ניתן למצוא משאב phenotyping התנהגות מעולה ז'קלין של קרולי, מה לא בסדר עם העכבר שלי? 1. אנחנו הראשונים להשתמש בסוללה שונה במבחן תצפיתי להעריך את הבריאות הכללית של הנושא. הסוללה כוללת פריטים מתוך פרוטוקול הערכה מקיפה של סמואל ארווין 2 כדי לזהות במהירות בנושאים אלה יהיה מתאים בדיקות נוספות. בקיצור, מזהה את הסוללה שונה חיות כי הם חריגים מבחינה פיזית (למשל קשות מתחת או מעל משקל, המוזנח, כבד נשימה) או תנוחה חריגה התערוכה, תנועה או התנהגויות. כל אלה יכולים להיות ביטויים של מחלה. כל הערכה הראשונית דומה מזהה נושאים בריא מתאים.
חשוב גם לציין כי בעלי החיים משמשים אנושי הן במהלך הבחינה בריאות כללית, כמו גם במהלך בדיקות עוקבות. ללא הרדמה או שיכוך כאבים משמש בדיקות אלה אינם כוללים הליכים כואבים בפוטנציה.
בדיקת רגישות חוש הריח
בדיקה זו נועדה לזהות הבדל ברגישות חוש הריח בין שתי קבוצות של עכברים (סוג למשל פראי קבוצת מוטנטים בעלי חיים). בבדיקה זו, דילולים מרובים של ריח נעשים. בעלי חיים תמימים אז חוקר דילול אחת של ריח זה הזמן גישוש הכולל (תוך 3 דקות) נרשם. דילולים מרובים הריח נוסו על, בנושאים שונים נאיבי והזמן גישוש בסך הכל משמש להפקת בתגובה מנה עקומות עבור כל קבוצה של עכברים. שני חוקרים צריכים להיות מעורבים בדיקות, עם עיוור אחד גנוטיפים נושא ו / או תנאי.
חוקר ראשי
- השג ארבעה כלובים נקיים (8 גובה X 10 W x 18 L, באינצ'ים), ללא כל מצע. הקו עד ארבעה כלובים בממשלה biosafety.
- הגדרת מחיצות בין הזירה כל שימוש בנייר מסנן אטום. מניחים הבריסטול השחור על פני החלוקה הסופית כך את הקווים השחורים בצד את הצד התחתון של הכלוב. מכסים את החלק העליון של הזירה עם חתיכת ברורה של פרספקס כדי לאפשר האור כדי להאיר את הזירה.
(א)
(ב) 
באיור 1. ארנה Set-up. (א) עטוף כהלכה, בזירה ריקה (ב) ארנה בנייר מסנן הנושא ריחניים. - בגין הרגלה הנושאים. הנח את הנושא הראשון בכלוב הראשון הרגלה. לאחר 15 דקות, להעביר את הנושא הראשון לכלוב השני. לנקות את הכלוב הראשון עם שחפת Quatricide. בשלב הבא, המקום הנושא השני בכלוב, תחילה לנקות. המשך בתהליך זה בנושאים הבאים. בסופו של דבר, כל נושא צריך להיות מורגל בכל שלושת הכלובים לפני שיוצבו בזירה (כלוב הרביעי והאחרון) לעוד 15 דקות של התרגלות לפני הבדיקה.
(ב) 
העיוור חוקר
- הפוך את המספר המתאים של 2 אינץ' על 2 אינץ' ריבועים של נייר סינון עבור דגימות ריח.
- באמצעות ריח שנבחרו מראש, בהתאם לדלל אותו. לקבלת דוגמיות הידרופובי כגון חמאת בוטנים, להשתמש בשמן כמו ממס; עבור כל האחרים, יש להשתמש במים מזוקקים. וורטקס.
- הגדרת מכשיר הקלטת וידאו דיגיטלי בקצה המרוחק של הממשלה biosafety כזה בסוף כלוב כולו בפוקוס. קח וידאו ראשונית על מנת להבטיח פרמטרים נאותים.
- הקלט את הסדר שבו דילולים ייבדקו, מקפיד באופן אקראי את סדר המשפטים.
- נושא שיא של פסולת מספרי זיהוי.
- לאחר הנושא כבר מורגל במשך 15 דקות בזירה, להתחיל לקראת במשפט הראשון. פיפטה דילול הראשונים במעלה ובמורד בצינור חרוטי לפני pipetting אותו על ריבוע נייר הסינון. משטח נייר לסנן בצורה אופטימלית צריך להיות מכוסה ~ 85% (כ 0.50-MLS של פתרון). השתמש kimwipe כדי לוודא נייר הסינון אינו רווי יתר על המידה.
- בגין הקלטת וידאו.
- מניחים את ריבוע נייר לסנן בכלוב בצד הנגדי של המיקום הנוכחי של בעל החיים.
- בגין תזמון.
- לאחר 3 דקות, לעצור את ההקלטה ולהסיר את ריח מדולל.
- אם רק אחד ריח (למשל קינמון) הוא להיבדק, להסיר את הנושא המבחן הראשון מהזירה. חזור על שלבים 6-11 עבור כל חיה, כראוי דילול ריח לכל נושא. אם אחד או יותר של הריח הוא להיבדק, אך לא להסיר את נושא הבדיקה מהזירה. במקום זאת, העיתוי להתחיל.
- כמתבקש לדלל את הניחוח הבא בשיטות כמו המפורטות לעיל.
- אחרי דקה 1, להתחיל בהקלטת וידאו. מניחים את ריבוע נייר פילטר עם דילול של ניחוח הבא בכלוב בצד השני של positio הנוכחי של החיההערה
- חזור על שלבים 6-13 עבור כל ריח, וציין את מספר קובץ הווידאו עבור כל ניסוי.
- חזור על שלבים 6-14 עבור כל נושא.
איור 2. תוצאות נציג לישיבה של בדיקות רגישות חוש הריח. העכבר כל מקבוצת או שליטה (קבוצה א) או קבוצת הניסוי (קבוצה B) נחשף אחד מחמשת דילולים שונים של תמצית קינמון על נייר לסנן לגבי מושב אחד, שלוש, דקה. סה"כ זמן לחקור את נייר הסינון הוערכה. העכברים בקבוצה A יש רגישות חוש הריח יותר מאשר אלו בקבוצת B.
העדפות בדיקת חוש הריח
בדיקה זו נועדה לזהות ליקויים זיהוי ספציפי, כלומר את היכולת לחוש ריחות אטרקטיביים או מרתיעה. ההליך הבא לווה בנדיבות מן הפרוטוקול של Kobayakawa, K., et al.3. שוב, שני חוקרים צריכים להיות מעורבים בדיקות, עם עיוור אחד גנוטיפים נושא ו / או מצבו. השעה גישוש בסך הכל נרשם שוב (עם הצגת וידאו) עבור ריחות שונים. ריחות אלה עם פעמים גישוש הכולל יותר מים המיועדים כמו "אטרקטיבי", בעוד אלה עם פעמים פחות מים מכונים "מרתיעה". החוקר אז ישקול אם ריחות אותו הם "מושכים" או "מרתיעה" עבור נבדקים שונים.
אנא עקוב אחר צעדים 1-3 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של החוקר הראשי.
העיוור חוקר
הנוהל לבדיקת העדפה הריח הוא זהה, עם שינויים קלים של שלבים 2 ו 4. אנא עקוב אחר הצעדים 1-15 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של חוקר העיוור, עם השינויים הבאים: בשלב 2, באמצעות ניחוחות שנבחרו מראש (שילוב של שני ריחות אטרקטיביים מרתיעה), להפוך את פתרונות מדולל כראוי של כל אחד צינורות חרוטי. לקבלת דוגמיות הידרופובי כגון חמאת בוטנים, להשתמש בשמן כמו ממס; עבור כל האחרים, יש להשתמש במים מזוקקים. וורטקס. עבור לשלב 4, במקום להקליט את דילול להיבדק, להקליט את הסדר של ריחות מגוונים כי תיבחן, באופן אקראי, את הסדר של המשפטים.
בדיקה זו נועדה לזהות ליקויים זיהוי ספציפי, כלומר את היכולת לחוש ריחות אטרקטיביים או מרתיעה. ההליך הבא לווה בנדיבות מן הפרוטוקול של Kobayakawa, K. et al. 3. שוב, שני חוקרים צריכים להיות מעורבים בדיקות, עם עיוור אחד גנוטיפים נושא ו / או מצבו. השעה גישוש בסך הכל נרשם שוב (עם הצגת וידאו) עבור ריחות שונים. ריחות אלה עם פעמים גישוש הכולל יותר מים המיועדים כמו "אטרקטיבי", בעוד אלה עם פעמים פחות מים מכונים "מרתיעה". החוקר אז ישקול אם ריחות אותו הם "מושכים" או "מרתיעה" עבור נבדקים שונים.
אנא עקוב אחר צעדים 1-3 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של החוקר הראשי.
העיוור חוקר
הנוהל לבדיקת העדפה הריח הוא זהה, עם שינויים קלים של 2 שלבים, 4 ו 13. אנא עקוב אחר הצעדים 1-15 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של חוקר העיוור, עם השינויים הבאים: בשלב 2, באמצעות ניחוחות שנבחרו מראש (שילוב של שני ריחות אטרקטיביים מרתיעה), להפוך את פתרונות מדולל כראוי של כל אחד צינורות חרוטי. לקבלת דוגמיות הידרופובי כגון חמאת בוטנים, להשתמש בשמן כמו ממס; עבור כל האחרים, יש להשתמש במים מזוקקים. וורטקס. עבור לשלב 4, במקום להקליט את דילול להיבדק, להקליט את הסדר של ריחות מגוונים כי תיבחן, באופן אקראי, את הסדר במשפט אחד. עבור השלב 13, במקום מרובע נייר פילטר עם ניחוח הבא בכלוב בצד הנגדי של המיקום הנוכחי של בעל החיים.
איור 3. תוצאות נציג לישיבה של בדיקות העדפה חוש הריח. העכבר כל נחשף לכל אחד ריחות שונים על נייר לסנן לגבי מושב אחד, שלוש, דקה. סה"כ זמן לחקור את נייר הסינון הוערכה. חמאת בוטנים ווניל הם ריחות אטרקטיביים (ניחוח זמן גישוש> מים בזמן גישוש) ו 2-Methylbutyric חומצה היא מרתיעה (ניחוח זמן גישוש <מים בזמן גישוש).
ניקוד של בדיקות חוש הריח
לאחר רכישת כל רגישות חוש הריח וסרטי וידאו העדפה, יש צורך לנתח את סה"כ זמן לחקור כל דילול / ריח. האם החוקר עיוור לנתח את כל קטעי וידאו על עקביות.
- תצוגה מקדימה של vidאיו, וציין את הדברים הבאים: א) כאשר נייר הסינון ממוקם בזירה, ב) כאשר העכבר מתקרב נייר פילטר, ג) כאשר העכבר חוקר את נייר לסנן ד) כאשר שלוש דקות חלפו (מ כאשר המסנן הנייר הונח בזירה). לדעת מתי להתמקד בהתנהגות של העכבר מקלה במדויק הציון סה"כ זמן לחקור לאחר בדיקתה.
- סקירת וידאו. הערה הזמן כאשר העכבר הראשון חוקר את נייר הסינון (latency).
- שימוש זמן, סטופר חקירות כל תוך שלוש דקות של הצבת נייר לסנן בזירה. השעה החקירה מוגדרת עת כאשר nares של העכבר הם <1 מ"מ מהעיתון הסינון. חשוב שלא לכלול כל הזמן כאשר סמן העכבר נמצא בסמיכות נייר הסינון, אך אינו פעיל חוקרת אותו. אין לכלול התקפי ללקק וללעוס את הנייר או התקפי יושב על הנייר בזמן גישוש מוחלט. זה הכרחי כדי לדבוק מקרוב בעקביות כללים אלה במדויק לנתח התנהגות חוש הריח.
- השהיית זמן שיא, את סך כל הזמן בילה בחקירת נייר לסנן קובץ וידאו מספר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבדיקות הנ"ל מאפשרים הערכה מהירה ואמינה של תפקוד בסיסי חוש הריח. זה לא יהיה להתעלם, עם זאת, כי אמינות זה מחייב את הבחירה הכנה נאותה של נושאים לבדיקה. בעלי חיים חולה או נכה אחרת הם לעתים קרובות הנבדקים מבחן עקבית. כמו כן, הרגלה של נבדקים היא המפתח. מצאנו כי השימוש בכלובים מרובות במהלך תהליך הרגלה מאפשר החיות להיות נוח עם הנסיין טיפול ושינוי הסביבה. מצאנו גם כי זמנים קצרים יותר מאשר אלו הצביעו על הרגלה אינן מספיקות כדי להפחית את החרדה. חיות חרדה גם הם לעתים קרובות הנבדקים מבחן בלתי צפוי יכול לטשטש הבדלים אמיתיים.
בבדיקה בפועל של העכברים, חשוב לא רק להיות עקבי כאשר רכישת נתונים, אלא גם בניתוח התנהגות הנבדקים. מצאנו אותו שימושי רק לספור את הזמן כאשר האף הנושא של הבדיקה <1 מ"מ מהעיתון לסנן כחלק הזמן גישוש מוחלט. כמו כן, התנהגויות כגון לנשוך או ללעוס את הנייר לסנן אינם נכללים בזמן גישוש מוחלט. בנוסף, זמן אחזור (עבור ריחות אטרקטיביים) יכול להיות גם מדד שימושי. שונות ורקעים עכברים עשויה לדרוש דילולים שונים של ריחות לאפליה יעיל בין שליטה לבין קבוצת הניסוי. כמו כן, חשוב להתאים את מין וגיל, להתאים זוגות. מצאנו את זה מועיל כדי להפיק באופן אמפירי דילולים ריח המתאים (בנושאים דומים בקבוצת הביקורת) לפני שתמשיך בדיקות ניסיוניות של עכברים נאיבי. לבסוף, בדיקות אלה נבחרו כדי למזער את ההשפעה של כל ליקויי קוגניטיביים אחרים, בעיקר, ליקויים למידה ו / או זיכרון. לשם כך, חשוב להשתמש בעכברים תמימים לבדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מפקדת סטיוארט & ויקטוריה אחוות קוואן Predoctoral (RMW), פרס NIH פיוניר (RAS)
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
