Summary
Propiedades fundamentales, sin embargo, exclusiva del sistema olfativo de roedores han llevado a su estudio cada vez mayor entre los biólogos. Una evaluación relativamente simple de su función se necesita también. A continuación se describen las pruebas sensibles para la caracterización de la sensibilidad del ratón olfativo y preferencias.
Abstract
El sistema olfativo de roedores es de interés creciente para los científicos, estudió, en parte, a la biología de sistemas, debido a su sistema de circuitos estereotipados, pero accesible. Además, la capacidad única de esta zona para generar nuevas neuronas durante la vida de un organismo lo convierte en un atractivo sistema para los biólogos del desarrollo y la regeneración por igual. Ese interés hace necesario un medio para una evaluación rápida, pero confiable de la función olfatoria. Muchas pruebas de la capacidad olfativa es compleja, variable o no diseñados específicamente para los ratones. Además, algunas pruebas son sensibles a los déficits de memoria, así como defectos en la capacidad olfativa, confundiendo a los resultados obtenidos.
Aquí se describe una batería simple de pruebas diseñadas para detectar defectos en la sensibilidad olfativa y la preferencia. En primer lugar, una evaluación inicial de la salud en general permite la identificación de los animales adecuados para su análisis posterior. En segundo lugar, los ratones son expuestos a diferentes diluciones de los olores para determinar si hay una diferencia de umbral. En tercer lugar, los ratones se presentan con varios olores, atractivo y desagradable, que permitan la evaluación de las preferencias olfativas. Estos estudios simples que hacen la caracterización inicial de comportamiento olfativo accesible para los laboratorios de la variedad de recursos y la experiencia.
Protocol
Examen General de Salud
Un tratamiento más completo de los exámenes de salud en general se encuentran en excelentes Jacqueline Crawley recursos fenotipo conductual, ¿qué pasa con mi ratón? 1. En primer lugar, utilice una batería modificada prueba observacional para evaluar la salud general del sujeto. La batería incluye los elementos de protocolo completo de evaluación de Samuel Irwin 2 a identificar rápidamente los temas que serán aptos para su análisis posterior. En resumen, la batería modificado identifica los animales que se encuentran físicamente anormal (por ejemplo, gravemente insuficiente o excesiva de peso, no se arreglan, disnea) o que presentan una postura anormal de locomoción, o comportamientos. Todos ellos podrían ser manifestaciones de la enfermedad. Cualquier evaluación inicial que de manera similar, los sujetos no saludables es el adecuado.
También es importante tener en cuenta que los animales se utilizan con humanidad, tanto durante el examen de salud general, así como durante las pruebas posteriores. Sin anestesia o analgesia se utiliza como estas pruebas no poner en marcha procedimientos potencialmente dolorosos.
Prueba de la sensibilidad olfativa
Este test está diseñado para detectar una diferencia en la sensibilidad olfativa entre los dos grupos de ratones (por ejemplo, un tipo salvaje y un grupo de mutantes de los animales). En esta prueba, múltiples diluciones de un perfume se hacen. Un animal inocente entonces investiga una sola dilución del aroma y el tiempo total de exploración (a menos de 3 minutos) se registra. Diluciones múltiples de la fragancia son probados en diferentes temas, ingenuo y el tiempo total de exploración se utiliza para generar las curvas de dosis-respuesta para cada grupo de ratones. Dos investigadores deben participar en las pruebas, con una ciega a los genotipos tema y / o condición.
Investigador principal
- Obtener cuatro jaulas limpias (8 x 10 x W 18 L, en pulgadas), sin ropa de cama. Alinee las cuatro jaulas en la cabina de bioseguridad.
- Configurar las particiones entre cada escena con papel de filtro opaco. Colocar un cartel negro en la partición final de tal manera que las líneas laterales del lado negro y el fondo de la jaula. Cubra la parte superior de la arena con un pedazo de plexiglás transparente para permitir la luz para iluminar la arena.
(A)
(B) 
Figura 1. Arena Set-Up. (A) estar bien cubierto, arena vacía (b) Arena con papel de filtro sujeto y perfumadas. - Comience habituar a los sujetos. Coloque el primer tema en la primera jaula de habituación. Después de 15 minutos, mueva el primer tema de la segunda jaula. Limpie la jaula primero con TB Quatricide. Luego, coloque la segunda asignatura en la primera jaula, limpiar. Continuar este proceso con los temas siguientes. En última instancia, cada individuo debe ser habituado en las tres jaulas antes de ser colocado en la arena (caja de cuarta y final) por otros 15 minutos de habituación antes de la prueba.
(B) 
Investigador ciego
- Hacer un número apropiado de 2 pulgadas por 2 pulgadas cuadrados de papel de filtro para las muestras de perfume.
- Utilizando el aroma pre-seleccionados, debidamente diluirlo. Para las muestras hidrofóbicas tales como mantequilla de maní, el uso del petróleo como solvente, para todos los demás, el uso de agua destilada. Vortex.
- Establecer un dispositivo de grabación de video digital en el otro extremo de la cabina de bioseguridad de tal manera que al final toda la jaula está en foco. Grabar un vídeo previo a garantizar los parámetros son los adecuados.
- Registrar el orden en que las diluciones se pondrá a prueba, teniendo cuidado al azar el orden de los ensayos.
- Individuo del registro de la basura y los números de identificación.
- Una vez que el tema se ha acostumbrado durante 15 minutos en el terreno, comenzar la preparación para la primera prueba. Pipeta de la primera dilución arriba y hacia abajo en el tubo cónico que antes de pipetear en un cuadrado de papel de filtro. La superficie de papel de filtro debe cubrir de manera óptima y el 85% (aproximadamente 0,50 ml de solución). Use un Kimwipe para asegurarse de que el papel de filtro no es demasiado saturado.
- Iniciar la grabación de vídeo.
- Coloque el cuadrado de papel de filtro en la caja en el extremo opuesto de la posición actual del animal.
- Empezar a cronometrar.
- Después de 3 minutos, detenga la grabación y quitar el olor a diluirse.
- Si sólo hay un olor (por ejemplo, la canela) se va a probar, eliminar la materia primera prueba de la arena. Repita los pasos 6-11 para cada animal, adecuada dilución de la esencia de cada tema. Si más de un olor se va a probar, sin embargo, no retire el sujeto de la prueba de la arena. En su lugar, empezar a cronometrar.
- Adecuadamente diluir el olor siguiente con los mismos métodos que se enumeran más arriba.
- Después de 1 minuto, inicie la grabación de vídeo. Coloque el cuadrado de papel de filtro con la dilución de la próxima fragancia de la jaula en el extremo opuesto de la positio actual de los animalesn.
- Repita los pasos 6-13 para cada aroma, teniendo en cuenta el número de archivos de vídeo para cada ensayo.
- Repita los pasos 6-14 para cada tema.
Figura 2. Los resultados representativos para una sesión de pruebas de sensibilidad olfativa. Cada ratón, ya sea del grupo de control (Grupo A) o el grupo experimental (grupo B) fue expuesto a una de las cinco distintas diluciones de extracto de canela en papel de filtro por su parte, la sesión de tres minutos. El tiempo total dedicado a explorar el papel de filtro se evalúa. Los ratones del grupo A tienen una mayor sensibilidad olfativa que los del grupo B.
Prueba de preferencia olfativa
Esta prueba está diseñada para identificar las deficiencias específicas de detección, es decir, la capacidad de detectar olores atractivo o repulsivo. El siguiente procedimiento toma libremente del protocolo de Kobayakawa, K., et al3. Una vez más, dos investigadores deben participar en las pruebas, con una ciega a los genotipos tema y / o condición. El tiempo total de exploración se registra de nuevo (al ver video) para varios olores. Los olores con un total de tiempos de exploración más que el agua se designan como "atractivo", mientras que aquellos con tiempos de menos de agua que se denomina "aversión". La investigadora examina si los olores mismo son "atractivos" o "desagradable" para los sujetos de prueba diferentes.
Por favor, siga los pasos 1-3 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador principal.
Investigador ciegos
El procedimiento para la prueba de preferencia olfativa es el mismo, con ligeras modificaciones de los pasos 2 y 4. Por favor, siga los pasos 1-15 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador ciego, con los cambios siguientes: Para el paso 2, con los olores pre-seleccionados (una combinación de aromas atractivos y aversivo), hacen que las soluciones adecuadamente diluida de cada uno en tubos cónicos. Para las muestras hidrofóbicas tales como mantequilla de maní, el uso del petróleo como solvente, para todos los demás, el uso de agua destilada. Vortex. Para el paso 4, en lugar de grabación de la dilución a ensayar, grabar la orden de los aromas variados que se pondrá a prueba, asignaron al azar el orden de los ensayos.
Esta prueba está diseñada para identificar las deficiencias específicas de detección, es decir, la capacidad de detectar olores atractivo o repulsivo. El siguiente procedimiento toma libremente del protocolo de Kobayakawa, K. et al. 3. Una vez más, dos investigadores deben participar en las pruebas, con una ciega a los genotipos tema y / o condición. El tiempo total de exploración se registra de nuevo (al ver video) para varios olores. Los olores con un total de tiempos de exploración más que el agua se designan como "atractivo", mientras que aquellos con tiempos de menos de agua que se denomina "aversión". La investigadora examina si los olores mismo son "atractivos" o "desagradable" para los sujetos de prueba diferentes.
Por favor, siga los pasos 1-3 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador principal.
Investigador ciegos
El procedimiento para la prueba de preferencia olfativa es el mismo, con ligeras modificaciones de los pasos 2, 4 y 13. Por favor, siga los pasos 1-15 en la sección de pruebas de sensibilidad olfativa para el investigador ciego, con los cambios siguientes: Para el paso 2, con los olores pre-seleccionados (una combinación de aromas atractivos y aversivo), hacen que las soluciones adecuadamente diluida de cada uno en tubos cónicos. Para las muestras hidrofóbicas tales como mantequilla de maní, el uso del petróleo como solvente, para todos los demás, el uso de agua destilada. Vortex. Para el paso 4, en lugar de grabación de la dilución a ensayar, grabar la orden de los aromas variados que se pondrá a prueba, asignaron al azar el orden en cada ensayo. Para el paso 13, el lugar de la plaza de papel de filtro con el olor siguiente en la jaula en el extremo opuesto de la posición actual del animal.
Figura 3. Los resultados representativos para una sesión de pruebas de las preferencias olfativas. Cada ratón fue expuesto a cada uno de los diferentes aromas en papel de filtro por su parte, la sesión de tres minutos. El tiempo total dedicado a explorar el papel de filtro se evalúa. La mantequilla de maní y vainilla son los olores atractivos (aroma tiempo de exploración> agua de tiempo de exploración) y 2-metilbutirato ácido es aversivo (aroma tiempo de exploración <agua de tiempo de exploración).
La puntuación de las pruebas olfativas
Después de adquirir toda la sensibilidad olfativa y videos preferencia, es necesario analizar el tiempo total dedicado a explorar cada dilución / olor. Tiene el investigador ciego analizar todos los videos de la coherencia.
- Vista previa de la video, teniendo en cuenta lo siguiente: a) cuando el papel de filtro se coloca en el campo, b) cuando el ratón se acerca al papel de filtro, c) cuando el ratón se investiga el papel de filtro y d) cuando han transcurrido tres minutos (a partir de cuando el filtro papel fue colocado en la arena). Saber cuándo se centran en el comportamiento del ratón hace que sea más fácil de marcar con precisión el tiempo total dedicado a explorar después de la revisión.
- Revisar el video. Tenga en cuenta el momento en que el primer ratón investiga el papel de filtro (latencia).
- Con un cronómetro, el tiempo de todas las investigaciones a los tres minutos de colocar el papel de filtro en la arena. El momento de la investigación se define como cualquier momento en las fosas nasales del ratón son <1 mm del papel de filtro. Es importante no incluir ninguna de las veces cuando el ratón está muy cerca del papel de filtro, pero no está activamente investigando. No incluyen episodios de masticar y lamer el papel o los combates de sentarse en el papel en el tiempo de exploración total. Es necesario adherirse firmemente y constantemente a estas reglas para analizar con precisión el comportamiento olfativo.
- Un tiempo récord de latencia, el tiempo total dedicado a investigar el papel de filtro y el número de archivos de vídeo.
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Discussion
Las pruebas anteriores permiten la evaluación rápida y fiable de la función olfatoria básica. No debe pasarse por alto, sin embargo, que esta fiabilidad exige la adecuada selección y preparación de materias para la prueba. Los animales enfermos o incapacitados de lo contrario son a menudo sujetos inconsistentes. Además, la habituación de los sujetos de prueba es la clave. Hemos encontrado que el uso de varias jaulas durante el proceso de habituación permite que los animales se sientan cómodos con el manejo experimentador y el cambio de entorno. También hemos encontrado que los tiempos más cortos de los indicados para la habituación no son suficientes para reducir la ansiedad. Animales ansiedad también son a menudo imprevisibles sujetos de prueba y puede ocultar las verdaderas diferencias.
En la prueba real de los ratones, es importante no sólo para ser consistentes en la adquisición de los datos, sino también en analizar el comportamiento de los sujetos. Hemos encontrado que es útil contar con sólo ese momento cuando la nariz del sujeto de prueba es <1 mm del papel de filtro como parte del tiempo de exploración total. Además, los comportamientos, tales como morder o masticar el papel de filtro no se incluyen en el tiempo de exploración total. Además, el tiempo de latencia (de olores atractivos) también puede ser un indicador útil. Fondos de ratones diferentes pueden requerir diferentes diluciones de los olores de la discriminación efectiva entre un control y grupo experimental. También es importante el sexo del partido y los pares coinciden con la edad. Hemos encontrado que es útil para derivar empíricamente las diluciones adecuadas olor (sobre temas similares a los del grupo control) antes de proceder con la prueba experimental de ratones ingenuo. Finalmente, estas pruebas fueron seleccionados para minimizar el efecto de cualquier otro deterioro cognitivo, sobre todo, los defectos en el aprendizaje y / o la memoria. Para ello, es fundamental utilizar ratones ingenuo para las pruebas.
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Acknowledgments
Financiación: Este trabajo fue apoyado por un cuartel general Stuart & Victoria beca predoctoral Quan (RSR), el premio Pioneer NIH (RAS)
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
