תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש
Summary
במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.
Abstract
Cultured העיקרי מכרסמים מבוגרים לתאי לב הם מערכת מודל חשוב למחקר קרדיווסקולרי. עם זאת, הקמתה של החזקה, myocytes קיימא מבוגר תרבותי יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, שער הגבלת צעד עבור חוקרים רבים. כאן אנו תיאר פרוטוקול להשיג תשואה גבוהה של מבוגר לב myocytes עכברוש שנותרו קיימא בתרבות במשך כמה ימים. הלב הוא מבודד perfused עם collagenase ו פרוטאז תחת Ca נמוך<sup> 2 +</sup> התנאים להתאושש myocytes יחיד. Ca<sup> 2 +</sup> עמיד תאים מתקבלים על ידי עליות בשלבים ב Ca תאיים<sup> 2 +</sup> ריכוז בשלושה שלבים לשטוף הבאים. תאים מסוננים, resuspended במדיום תרבות, מצופה על תלושי laminin מצופה. Myocytes Cultured שהושגו באמצעות פרוטוקול זה הם קיימא עבור עד ארבעה ימים ומתאימים רוב הניסויים כולל electrophysiology, ביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית הדמיה.
Protocol
Discussion
הצעד הקריטי הוא המהירות שבה את הלב מבודד הוא תלה על מערכת זלוף. אורך תקופת עיכול אנזימטי עשוי להיות קצת שונה עבור כל חולדה. ההתאמה תלוי כמה רך הלב הופך לאחר תקופת סדירה של מערכת העיכול. ההתאוששות באיטיות של Ca 2 + לאחר עיכול אנזים חיוני להשגת Ca 2 +-סובלנית תאים …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S6191 | ||
| KCl | Sigma | P9541 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| K2HPO4 | Sigma | P9666 | ||
| MgSO4 | Fluka | 63068 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| CaCl2 | Sigma | C7902 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H4784 | ||
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| Protease XIV | Sigma | P5147 | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | ||
| Carnitine | Sigma | C9500 | ||
| Taurine | Sigma | T0625 | ||
| Glutamic Acid | Sigma | G1501 | ||
| BSA | Sigma | A3294 | ||
| Creatine | Sigma | C3630 | ||
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | ||
| Media 199 | GIBCO | 11150 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Laminin | BD Bioscience | 354232 | ||
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | ||
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | ||
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
