الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر
Summary
في هذه الورقة ، ووصف لنا طريقة نموذجية لعزل والثقافة myocytes الكبار قلب الفئران. وتستخدم كولاجيناز البروتيني لهضم وعزل myocytes واحد. Myocytes مثقف اتبع هذا البروتوكول تلبية الاحتياجات الأكثر تجربة.
Abstract
مثقف القوارض خلايا البالغين قلب نظام الأساسي ونموذجا هاما للبحوث القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، يمكن إنشاء وقابلة للحياة قوية myocytes الكبار مثقف أن يكون تحديا تقنيا ، ومعدل منظم الخطوة لكثير من الباحثين. وصف نحن هنا بروتوكولا للحصول على غلة عالية من البالغين myocytes قلب الفئران التي لا تزال قابلة للحياة في الثقافة لعدة أيام. معزول القلب وperfused مع كولاجيناز والبروتيني منخفض تحت كا<sup> 2 +</sup> الظروف لاستعادة myocytes واحد. كاليفورنيا<sup> 2 +</supويتم الحصول على> الخلايا التي تتحمل زيادات تدريجية في الكالسيوم خارج الخلية<sup> 2 +</sup> التركيز في ثلاث خطوات غسل اللاحقة. يتم تصفية الخلايا ، معلق في وسط الثقافة ، ومطلي عن زلات laminin المغلفة. myocytes مثقف تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول قابلة للبقاء لمدة تصل إلى أربعة أيام ، وتكون مناسبة لمعظم التجارب بما في ذلك الكهربية ، والكيمياء الحيوية ، والتصوير والبيولوجيا الجزيئية.
Protocol
Discussion
والخطوة الحاسمة هي السرعة التي معلوق قلب معزولة حتى على نظام الارواء. ربما لطول فترة الهضم الأنزيمي تكون مختلفة قليلا عن كل فأر. التعديل يتوقف على مدى اللين قلب يصبح بعد فترة العادية الهضم. الانتعاش ببطء من كا 2 + بعد الهضم انزيم ضروري للحصول على الكالسيوم 2 +</su…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S6191 | ||
| KCl | Sigma | P9541 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| K2HPO4 | Sigma | P9666 | ||
| MgSO4 | Fluka | 63068 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| CaCl2 | Sigma | C7902 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H4784 | ||
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| Protease XIV | Sigma | P5147 | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | ||
| Carnitine | Sigma | C9500 | ||
| Taurine | Sigma | T0625 | ||
| Glutamic Acid | Sigma | G1501 | ||
| BSA | Sigma | A3294 | ||
| Creatine | Sigma | C3630 | ||
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | ||
| Media 199 | GIBCO | 11150 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Laminin | BD Bioscience | 354232 | ||
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | ||
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | ||
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
