Neste artigo, descrevemos uma forma típica para isolar e cultura miócitos adulto coração de rato. Colagenase e protease são usadas para digerir e isolar miócitos único. Miócitos cultivadas seguir este protocolo de responder às necessidades mais experiência.
Abstract
Cultura primária adulto células do coração de roedores são um sistema modelo importante para a pesquisa cardiovascular. No entanto, o estabelecimento de robusta, viável miócitos adulto culto pode ser um desafio técnico, passo limitante para muitos pesquisadores. Aqui nós descrevemos um protocolo para obter um alto rendimento de miócitos de ratos adultos coração que permanecem viáveis em cultura por vários dias. O coração é isolado e perfundido com colagenase e protease em Ca baixo<sup> 2 +</sup> Condições para recuperar miócitos único. Ca<sup> 2 +</sup> Tolerante células são obtidas por um aumento gradual no Ca extracelular<sup> 2 +</sup> Concentração em três etapas de lavagem subseqüente. Células são filtrados, ressuspenso em meio de cultura, e banhado em deslizamentos laminina revestido. Miócitos cultivadas obtidos utilizando este protocolo são viáveis por até quatro dias e são adequados para a maioria dos experimentos, incluindo eletrofisiologia, bioquímica, biologia molecular e de imagem.
Protocol
Preparação para a cirurgia Parte I. O dia antes da cirurgia de ratos, a certeza de que todas as soluções são feitas, mas não adicione nenhum enzimas ainda. Buffers A, B e do tampão de lavagem deve ser filtrado para todas as esterilidade antes do armazenamento. Os buffers devem ser todos armazenados a 4 ° C. 6-bem placas de cultura de tecido deve ser revestida com 10-20 mcg / mL laminina em 2 mL 1XSFM no dia anterior, bem como, e deve ser armazenado a 37 ° C em uma incubadora de C…
Discussion
Um passo crítico é a velocidade com que o coração isolado é preso no sistema de perfusão. A duração do período de digestão enzimática pode ser um pouco diferente para cada rato. O ajuste depende de como o coração se torna macia após o período regular de digestão. A recuperação lenta de Ca 2 + após digestão enzimática é essencial para a obtenção de Ca 2 + tolerante células saudáveis.
Para cobaia, o protocolo é o mesmo, exceto hialuronidase é u…