Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Summary

In diesem Papier haben wir beschrieben, eine typische Art und Weise zu isolieren und Kultur erwachsenen Ratte Herz Myozyten. Collagenase und Protease werden verwendet, um zu verdauen und zu isolieren einzelnen Myozyten. Myozyten kultivierten folgen Sie diesem Protokoll erfüllen die meisten Anforderungen Experiment.

Abstract

Cultured primäre erwachsenen Nagetieren Herzzellen sind ein wichtiges Modellsystem für Herz-Kreislauf-Forschung. Dennoch können Etablierung von robusten, tragfähigen kultivierten adulten Myozyten eine technisch anspruchsvolle, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt für viele Forscher. Hier haben wir beschrieben, ein Protokoll zu einer hohen Ausbeute an erwachsenen Ratte Herz Myozyten, die lebensfähig bleiben in der Kultur für mehrere Tage zu erhalten. Das Herz ist isoliert und perfundiert mit Kollagenase und Protease unter niedrigen Ca^{2 +} Bedingungen zu erholen einzelnen Myozyten. Ca^{2 +}-Tolerante Zellen sind durch schrittweise Erhöhung der extrazellulären Ca erhalten^{2 +} Konzentration in drei aufeinander folgenden Waschschritten. Die Zellen werden gefiltert, in Kulturmedium resuspendiert und plattiert auf Laminin beschichteten rutscht. Cultured Myozyten erhalten mit diesem Protokoll sind lebensfähig für bis zu vier Tage und sind für die meisten Experimente einschließlich Elektrophysiologie, Biochemie, Imaging-und Molekularbiologie geeignet.

Protocol

Teil I. Vorbereitung für die Chirurgie Am Tag vor der Ratte Chirurgie, stellen Sie sicher, dass alle Lösungen hergestellt werden, aber fügen Sie keine Enzyme noch. Puffer A, B und der Waschpuffer sollten alle für die Sterilität gefiltert werden, bevor Lagerung. Die Puffer sollten alle bei 4 ° C gelagert werden 6-well-Zellkulturplatten muss mit 10-20 pg / mL Laminin in 2 mL 1XSFM am Vortag sowie beschichtet werden, und sollte bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator gelagert werden. …

Discussion

Ein entscheidender Schritt ist die Geschwindigkeit, mit der das isolierte Herz auf der Perfusion System eingehängt ist. Die Länge der enzymatische Verdauung Zeitraum kann ein wenig anders für jede Ratte. Die Einstellung hängt davon ab, wie weich das Herz wird nach der regulären Zeit der Verdauung. Die langsam Erholung der Ca ^{2 +} nach Enzymverdau unerlässlich für den Erhalt von Ca ^{2 +-tolerant} gesunden Zellen ist.

Für Meerschweinchen, ist das Protokoll, das gleic…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NaCl		Sigma	S6191
KCl		Sigma	P9541
HEPES		Sigma	H4034
K2HPO4		Sigma	P9666
MgSO4		Fluka	63068
Glucose		Sigma	G7021
CaCl2		Sigma	C7902
Heparin Sodium Salt		Sigma	H4784
Collagenase Type II		Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV		Sigma	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)		Sigma	B0753
Carnitine		Sigma	C9500
Taurine		Sigma	T0625
Glutamic Acid		Sigma	G1501
BSA		Sigma	A3294
Creatine		Sigma	C3630
Antibiotic		Cellgro	30-009-CI
Media 199		GIBCO	11150
FBS		Hyclone	SH30071.03
Laminin		BD Bioscience	354232
water bath		Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump		Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate		Corning	3516