Первичные культуры взрослых Миоциты сердца крысы
Summary
В этой статье мы описали типичный способ, чтобы изолировать и культуры взрослых миоцитах сердца крысы. Коллагеназы и протеаз, которые используются, чтобы переварить и выделить одного миоцитов. Миоциты культурный следовать этому протоколу отвечает большинству требований эксперимента.
Abstract
Искусственный первичных клеток грызунов взрослого сердца являются важной модельной системой для сердечно-сосудистых исследований. Тем не менее, создание надежной, жизнеспособной культурной миоцитов взрослых может быть технически сложными, ограничение скорости шаг для многих исследователей. Здесь мы описали протокол для получения высокого выхода взрослой крысы сердце миоцитов, которые остаются жизнеспособными в культуре в течение нескольких дней. Сердце изолированы и озарен коллагеназы и протеаз при низкой Ca<sup> 2 +</sup> Условия для восстановления одного миоцитов. Калифорния<sup> 2 +</sup> Устойчивые клетки получаются путем ступенчатого увеличения внеклеточного Са<sup> 2 +</sup> Концентрация в трех последующих шагов стирки. Клетки фильтруют, ресуспендируют в культуральной среде, и высевают на ламинин покрытием скользит. Искусственный миоцитов полученные с помощью этого протокола являются жизнеспособными в течение четырех дней и подходят для большинства экспериментов в том числе электрофизиологии, биохимии, изображений и молекулярной биологии.
Protocol
Discussion
Важным шагом является скорость, с которой изолированного сердца вешается на перфузию системы. Длина ферментативных период пищеварения может быть немного различны для каждой крысы. Регулировка зависит от того, как мягкая сердце становится после очередного периода пищеварения. Медлен?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S6191 | ||
| KCl | Sigma | P9541 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| K2HPO4 | Sigma | P9666 | ||
| MgSO4 | Fluka | 63068 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| CaCl2 | Sigma | C7902 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H4784 | ||
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| Protease XIV | Sigma | P5147 | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | ||
| Carnitine | Sigma | C9500 | ||
| Taurine | Sigma | T0625 | ||
| Glutamic Acid | Sigma | G1501 | ||
| BSA | Sigma | A3294 | ||
| Creatine | Sigma | C3630 | ||
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | ||
| Media 199 | GIBCO | 11150 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Laminin | BD Bioscience | 354232 | ||
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | ||
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | ||
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
