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Biology

Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung

Published: May 3, 2024 doi: 10.3791/66079
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Engineering, Utah State University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .

Abstract

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine entscheidende Monoschicht in der äußeren Netzhaut, die für die Unterstützung von Photorezeptoren verantwortlich ist. RPE-Degeneration tritt häufig bei Krankheiten auf, die durch fortschreitenden Sehverlust gekennzeichnet sind, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Die Forschung zu AMD stützt sich oft auf menschliche Spenderaugen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), um das RPE darzustellen. Diese RPE-Quellen erfordern jedoch längere Differenzierungszeiträume und erhebliches Fachwissen für die Kultivierung. Darüber hinaus haben einige Forschungseinrichtungen, insbesondere in ländlichen Gebieten, keinen einfachen Zugang zu Spenderaugen. Es gibt zwar eine kommerziell erhältliche immortalisierte RPE-Zelllinie (ARPE-19), aber ihr fehlen wesentliche In-vivo-RPE-Eigenschaften und sie wird in vielen ophthalmologischen Forschungspublikationen nicht allgemein akzeptiert. Es besteht ein dringender Bedarf, repräsentative primäre RPE-Zellen aus einer leichter verfügbaren und kostengünstigeren Quelle zu beziehen. Dieses Protokoll erläutert die Isolierung und Subkultur von primären RPE-Zellen, die post mortem aus Schweineaugen gewonnen werden und vor Ort von kommerziellen oder akademischen Lieferanten bezogen werden können. Dieses Protokoll erfordert gängige Materialien, die typischerweise in Gewebekulturlabors zu finden sind. Das Ergebnis ist eine primäre, differenzierte und kostengünstige Alternative zu iPSCs, menschlichen Spenderaugen und ARPE-19-Zellen.

Introduction

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht, die sich in der äußeren Netzhaut zwischen der Bruch-Membran und den Photorezeptorenbefindet 1. RPE-Zellen bilden Tight Junctions mit Proteinen wie Zonula occludens-1 (ZO-1) und besitzen einen charakteristischen Phänotyp, der durch Pigmentierung und hexagonale Morphologie gekennzeichnetist 2,3. Diese Zellen tragen zur Blut-Netzhaut-Schranke bei, wodurch die Gesundheit der Photorezeptoren unterstützt und die Netzhauthomöostase aufrechterhaltenwird 4,5. Darüber hinaus spielen RPE-Zellen eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie Licht absorbieren und wesentliche Komponenten für die Photorezeptoren recyceln6. Zum Beispiel wandelt RPE65, ein Protein, das in RPE-Zellen stark exprimiert wird, all-trans-Retinylester in 11-cis-Retinolum 7,8. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die von RPE-Zellen ausgeführt werden, ist ihre Funktionsstörung an verschiedenen Krankheiten beteiligt, darunter altersbedingte Makuladegeneration und diabetische Retinopathie 9,10. Um das Verständnis von Netzhauterkrankungen zu verbessern und neue Behandlungen zu entwickeln, werden häufig In-vitro-Modelle der Netzhaut eingesetzt.

Um repräsentative Modelle gesunder oder erkrankter Netzhäute zu generieren, ist es zwingend erforderlich, einen mimetischen RPE-Zelltyp zu verwenden. Der kommerziell erhältlichen ARPE-19-Zelllinie fehlen native Phänotypen, wie z. B. Pigmentierung, während die Differenzierung von iPSCs Monate dauern kann 11,12,13. Obwohl menschliche Spenderaugen ideal sein können, sind sie für viele Forschungslabors oft nicht ohne weiteres verfügbar.

Hier haben wir eine Methode entwickelt, um Schweineaugen, die viele Ähnlichkeiten mit menschlichen Augen14 aufweisen, zur Gewinnung primärer RPE-Zellen zu verwenden. Diese primären porcinen RPE-Zellen wurden in mehreren Netzhautmodellen verwendet15,16. Diese Zellen sind nicht nur kostengünstig, sondern benötigen auch weniger Zeit für die Gewinnung als iPSCs oder Spenderaugen. Darüber hinaus weisen sie native Merkmale wie Pigmentierung und Mikrovilli auf. Während ähnliche Protokolle für die RPE-Extraktion von Schweinen existieren 17,18,19, validiert diese einfache und detaillierte Technik die enzymatische Dissoziation weiter und verwendet Materialien, die in den meisten Zellkulturlabors üblich sind.

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Protocol

Die bei diesem Verfahren verwendeten Augen werden post mortem von einer lokalen, vom USDA inspizierten Metzgerei gewonnen, und es werden keine Arbeiten mit lebenden Tieren durchgeführt. Nach der Tötung der Tiere vergehen ca. 2 Stunden, bis die Augen entkernt sind. Da Gewebezerfall auftreten kann, ist es wichtig, die Augen während des Transports kühl zu halten, um weiteren Verfall zu verhindern. Bei diesem Verfahren werden die Augen nach der Enukleation sofort in einen Kühlschrank gelegt. Anschließend wird der Beutel in einem 1000-ml-Polypropylen-Becherglas positioniert und in einem 8-Liter-Kühler von Eis umgeben. Es ist wichtig, die Augen nicht direkt auf das Eis zu legen. Sobald die Augen im Labor ankommen, wird die Isolierung der RPE-Zellen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Es ist wichtig, diesen Vorgang innerhalb von 3-5 Stunden abzuschließen. Dieses Protokoll wurde für die Verarbeitung von 10 Augen optimiert.

1. Vorbereitung von DNase-Stammaliquoten

HINWEIS: Es wird empfohlen, diesen Schritt vor der Isolierung durchzuführen.

  1. Bereiten Sie eine 5 mM Calciumchloridlösung mit sterilem deionisiertem Wasser vor.
    ACHTUNG: Calciumchloridpulver kann schwere Augenreizungen oder -schäden verursachen. Tragen Sie geeignete PSA.
  2. Fügen Sie 5 mM Calciumchloridlösung zu DNase-Pulver hinzu (siehe Materialtabelle), um eine endgültige DNase-Konzentration von 3 mg/ml zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung gründlich gemischt ist.
    ACHTUNG: DNase ist eine Gefahr für die Sensibilisierung der Atemwege. Pulver/Substanz nicht einatmen.
  3. Aliquotieren Sie kleine Volumina, z. B. 1 ml, in Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Aliquote bis zur Verwendung bei -20 °C einfrieren.

2. Einrichten des Sezierbereichs

  1. Übertragen Sie die sterilen Sezierinstrumente und Zellkulturgeräte in die Biosicherheitswerkbank: OP-Abdecktuch, Petrischale, Zellsiebe, Well-Platten, Gaze, Pinzette, Skalpellgriff, Skalpellklinge und Irisschere (siehe Materialtabelle).
  2. Legen Sie das OP-Abdecktuch mit einer Pinzette aus. Legen Sie eine 6-Well-Platte auf das OP-Abdecktuch und entfernen Sie den Deckel.
  3. Legen Sie ein Aliquot der sterilen Dulbecco-Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis und in die Biosicherheitswerkbank.
  4. Füllen Sie eine Mulde einer 6-Well-Platte zur Hälfte (ca. 6 ml) mit 10% iger Povidon-Jod-Lösung.
  5. Füllen Sie die verbleibenden Vertiefungen mit gekühltem DPBS.
  6. Nehmen Sie den Deckel von einer der Petrischalen ab und legen Sie ihn umgedreht auf das OP-Tuch. Stellen Sie den Petrischalenboden als Abfallbehälter beiseite.
  7. Ein Aliquot von Zellkulturmedien (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% fetales Kälberserum (FBS), 1% Antibiotika/Antimykotika) und ein Aliquot von 0,25% Trypsin/EDTA in ein 37 °C heißes Wasserbad geben.
  8. Nehmen Sie die DNase-Stammlösung aus dem Gefrierschrank (siehe Rest des Protokolls für weitere Details).

3. Entfernung von äußerem Gewebe

HINWEIS: Die Entfernung von äußerem Gewebe kann außerhalb der Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Untersuchen Sie das Auge vor dem Schneiden, um sicherzustellen, dass die Sklera nicht punktiert wurde, die Pupille nicht beschlagen ist und der Sehnerv vorhanden ist. Entsorgen Sie Augen, die diese Kriterien nicht erfüllen.

  1. Während Sie den am Auge befestigten Muskel mit einer Hand halten, schneiden Sie mit der anderen Hand das Gewebe, das die Sklera umgibt, vorsichtig mit einem Skalpell ab. Achten Sie darauf, das Auge nicht zu zerquetschen oder versehentlich durch die Sklera zu schneiden. Wenn die Sklera durchtrennt ist und das schwarze Innere freilegt, entsorgen Sie das Auge.
    ACHTUNG: Ein schnittfester Handschuh wird dringend für die Hand empfohlen, die den Muskel hält, um sich vor versehentlichen Schnitten zu schützen.
  2. Schneiden Sie den Sehnerv mit einer gebogenen Irisschere auf eine Länge von nicht mehr als 3 mm ab. Wenn der Sehnerv zu lang ist, sitzt die Augenmuschel später nicht richtig im Zellsieb.
  3. Legen Sie das Auge mit der Hornhaut nach unten auf Eis.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3, bis das äußere Gewebe von jedem Auge entfernt ist.

4. Augendissektion

  1. Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Auge in die Biosicherheitswerkbank und in die Vertiefung mit 10% Povidon-Jod-Lösung zu übertragen, und drehen Sie das Auge, um sicherzustellen, dass es vollständig mit der Jodlösung beschichtet ist. Um die Werkzeuge so steril wie möglich zu halten, sollten diese Pinzetten nur zum Berühren der Außenseite des Auges verwendet werden.
  2. Während das Auge in Jodlösung sitzt, legen Sie eine sterile Gaze auf den flachen, umgekehrten Deckel der zuvor zubereiteten Petrischale. In eine separate Petrischale ein Zellsieb geben. Verwenden Sie das Zellsieb nur zur Unterstützung der Augenmuschel, nicht zur Zelltrennung.
  3. Nachdem Sie das Auge etwa 30 s lang in Jodlösung gelassen haben, waschen Sie das Auge, indem Sie es jeweils etwa 5 s lang in die Vertiefungen mit DPBS tauchen, von Vertiefung zu Vertiefung gehen, um die Jodlösung schrittweise zu verdünnen, und das Auge auf die sterile Gaze übertragen.
  4. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einem Skalpell unterhalb der Ora serrata oder etwa 1/3 des Globus vom Irisrand.
  5. Schneiden Sie nach dem Schnitt mit einer Irisschere gleichmäßig entlang des Umfangs des Globus, parallel zur Hornhaut. Verwenden Sie beim Manövrieren des Auges nur die Pinzette, um die Außenseite des Auges oder die Gaze zu berühren, um die Sterilität zu erhalten.
  6. Greifen Sie mit der Pinzette den Sehnerv und heben Sie die Kugel vorsichtig von der Gaze weg. Der Glaskörper sollte aus dem Globus fallen. Schütteln Sie bei Bedarf das Auge vorsichtig, um den Glaskörper zu lösen.
    HINWEIS: Wenn der Glaskörper sehr schwer zu entfernen ist, versuchen Sie, tiefer auf dem Globus zu schneiden.
  7. Legen Sie die Augenmuschel vorsichtig mit der Innenseite der Augenmuschel nach oben in das vorbereitete Zellsieb. Wenn Sie ungleichmäßig sind, verwenden Sie eine Pinzette, um die Augenmuschel so waagerecht wie möglich zu halten.
  8. Geben Sie abgekühltes DPBS vorsichtig in die Augenmuschel, sodass der Flüssigkeitsstand knapp unter dem tiefsten Punkt des Einschnitts liegt. Dieses DPBS wird nach der Entfernung der neuronalen Netzhaut entfernt.
    HINWEIS: Das Volumen des hinzugefügten DPBS variiert je nach Augengröße und Schnittstelle.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.8, bis alle Augen präpariert sind.

5. Entfernung der neuronalen Netzhaut und RPE-Dissoziation

HINWEIS: Der folgende Abschnitt ist einfacher in Etappen durchzuführen. In diesem Setup wird dieser Prozess jeweils an einer Charge (normalerweise 3 Augenmuscheln) durchgeführt. Bei den Schritten 5.1 bis 5.7 sollte jeder Schritt für den gesamten Stapel ausgeführt werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.

  1. Suchen Sie unter einer Taschenlampe alle Bereiche, in denen sich die neuronale Netzhaut (weiß/rosa) vom RPE (schwarz) zu lösen beginnt. Greifen Sie dann mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die angehobene neuronale Netzhaut und ziehen Sie sie ab.
    HINWEIS: Wenn es keine Bereiche gibt, in denen sich die neuronale Netzhaut ablöst, greifen Sie sie mit der Pinzette vorsichtig in der Nähe der Oberseite der Augenmuschel. Wenn bei dieser Methode das RPE/die Aderhaut beschädigt wird, werden diese Zellen während der RPE-Entnahme nicht dissoziiert.
  2. Sammeln Sie vorsichtig die neuronale Netzhaut in der Nähe der Papelle.
  3. Saugen Sie die neuronale Netzhaut mit einer Pasteur-Pipette ab, die an einem Vakuumabsaugsystem befestigt ist. Es wird empfohlen, die Aspiration zu federn, um den Entfernungsprozess zu unterstützen.
    HINWEIS: Eine Pipettenspitze kann auf das Ende einer Pasteurpipette gelegt werden, um die Saugkraft zu reduzieren.
  4. Fügen Sie vorsichtig zusätzliches gekühltes DPBS hinzu, um das Angesaugte zu ersetzen.
  5. Entfernen Sie die verbleibende neuronale Netzhaut, indem Sie erneut aspirieren. Entfernen Sie dieses Mal so viel DPBS wie möglich, ohne das freiliegende RPE zu stören.
  6. Geben Sie Trypsin vorsichtig in die Augenmuschel. Halten Sie den Volumenpegel unter der Inzisionslinie und allen Abschnitten beschädigter RPE, um Verunreinigungen zu reduzieren.
    ACHTUNG: Trypsin ist ein Enzym, das bei Kontakt Haut- und Augenreizungen verursacht. Tragen Sie geeignete PSA.
  7. Nachdem Trypsin in jedes Auge gegeben wurde, stellen Sie sicher, dass der Petrischalendeckel wieder aufgesetzt wird. Als nächstes wird die Petrischale 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einen befeuchteten Inkubator überführt.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.7 für jede Charge, bis alle Augenmuscheln verarbeitet sind.

6. RPE-Sammlung

  1. Sammeln Sie die RPE-Zellen von jeder Augencharge (2-3 Augen) und geben Sie sie in ein einzelnes 15-ml-Zentrifugenröhrchen, um den Aussaatprozess zu vereinfachen.
    1. Unter einer Taschenlampe vorsichtig mit einer 1000-μl-Pipette abreiben, um die RPE-Zellen zu entfernen. Wenn sich die RPE-Zellen nicht ablösen, fügen Sie frisches Trypsin hinzu und inkubieren Sie weitere 10-15 Minuten. Achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu kratzen.
    2. Sammeln Sie die RPE-Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    3. Waschen Sie die Augenmuschel mit Zellkulturmedien, um verbleibende Zellen zu sammeln und das Trypsin zu neutralisieren. Stellen Sie sicher, dass sich mindestens das doppelte Volumen des Trypsin-Mediums im 15-ml-Zentrifugenröhrchen befindet.
  2. Wiederholen Sie Schritt 6.1, bis RPE-Zellen aus allen Augenmuscheln entnommen wurden.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 250 x g für 5 min bei Raumtemperatur.

7. Vorbereiten der DNase-Arbeitslösung

  1. Berechnen Sie das Volumen von 3 mg/ml DNase-Stammlösung (hergestellt in Schritt 1), das für eine Endkonzentration von 100 μg/ml und ein Endvolumen von 3 ml pro Zellröhrchen zu Zellkulturmedien hinzugefügt werden muss (d. h. für drei Zentrifugenröhrchen mit Zellen sind 9 ml 100 μg/ml DNase-Lösung erforderlich).
  2. Kombinieren Sie die entsprechenden Volumina DNase-Stammlösung und Zellkulturmedien. Die Verwendung von DNase in der Arbeitslösung hilft, Zellverklumpungen zu verhindern und ermöglicht eine gleichmäßige Aussaat der Zellen.

8. Aussaat von RPE-Zellen

  1. Nach der Zentrifugation in Schritt 6.3 die Überstände von jedem 15-ml-Zentrifugenröhrchen entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass das Zellpellet nicht beschädigt wird.
  2. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 3 ml DNase-Arbeitslösung.
  3. Die 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit den resuspendierten Zellen werden 15 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einen befeuchteten Inkubator gegeben.
  4. Nach der Inkubation werden die Zellsuspensionen bei 150 x g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
  5. Entfernen Sie die Überstände und achten Sie darauf, die Zellpellets nicht zu stören.
  6. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 3 ml frischem Zellkulturmedium.
  7. Für jedes Zentrifugenröhrchen mit 2-3 Augen RPE-Zellen wird eine Vertiefung einer 6-Well-Platte (Durchgang 0) ausgesät.
  8. Übertragen Sie die besäte 6-Well-Platte vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.

9. Primäre RPE-Zellkultur für Schweine

  1. Lassen Sie die neu ausgesäten RPE-Zellen 48-72 h lang anhaften, bevor Sie die Platte bewegen. Während des ersten Medienwechsels kann eine Wäsche mit frischem Zellkulturmedium durchgeführt werden, um überschüssige Zelltrümmer zu entfernen.
  2. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium alle 48 h.
  3. Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, wechseln Sie zu einem Zellkulturmedium mit einer FBS-Konzentration von 2 % und halten Sie es bis zum Experimentieren aufrecht.

10. Validierung von RPE-Zellen

  1. Immunzytochemische (ICC) Färbung
    1. Fixieren Sie die Zellen in 4% Formaldehyd in DPBS für 10 min bei Raumtemperatur.
    2. Zweimal mit DPBS waschen.
    3. Permeabilisieren Sie die Zellen (falls erforderlich) mit 0,2 % Triton-X 100 in DPBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
    4. Zweimal mit DPBS waschen.
    5. Blockierende Lösung von 3% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS 1 h bei Raumtemperatur auftragen.
    6. Primärantikörper in einer Verdünnung von 1:100 (oder der empfohlenen Herstellerkonzentration) (siehe Materialtabelle) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C ruhen lassen.
    7. Dreimal mit DPBS für jeweils 5 min waschen.
    8. Sekundärantikörper (falls erforderlich) mit 2 μg/ml (oder empfohlener Herstellerkonzentration) (siehe Materialtabelle) hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur ruhen lassen.
    9. Dreimal mit DPBS für jeweils 5 Minuten waschen, wenn ein sekundärer Antikörper angewendet wird.
    10. Fügen Sie eine Kernfärbesonde in der Konzentration des Herstellers hinzu (siehe Materialtabelle) und lassen Sie sie 25 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
    11. Dreimal mit PBS waschen für jeweils 5 Minuten.
    12. Wenn Sie sich auf einem Zellkultureinsatz befinden, montieren Sie ihn mit einem Deckglas unter Verwendung eines Eindeckmediums, wie von Rickabaugh und Weatherston et al.20 beschrieben. Andernfalls werden Bildzellen in DPBS.
  2. Rasterelektronenmikroskopie (REM)
    1. Befolgen Sie das von Harris et al.21 beschriebene Verfahren.
  3. Transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER)
    1. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für die TEER-Messung (siehe Materialtabelle) mit 1 ml Kulturmedium in der Basalkammer15.
  4. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
    1. Führen Sie ELISA15 mit einem Multiplex-Assay-Kit für humane Enzyme gemäß dem Protokoll des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).

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Representative Results

Mit diesem Verfahren konnten primäre RPE-Zellen erfolgreich aus Schweineaugen isoliert werden. Abbildung 1A zeigt RPE-Zellen 3 Tage nach der Isolierung mit charakteristischer Pigmentierung. Nach 1 Woche Wachstum waren die Zellen vollständig konfluent und bildeten eine gesunde Monoschicht (Abbildung 1B). Die Zellen wurden dann in Zellkultureinsätze überführt, wo sie ihre Pigmentierung und Morphologie beibehielten (Abbildung 1C), was die Wirksamkeit des Isolierungsverfahrens weiter unterstützte. Kulturen, die diese Merkmale nicht aufwiesen und stattdessen eine abweichende Morphologie und übermäßige Pigmentierung aufwiesen (Abbildung 1D), standen im Verdacht einer zellulären Kontamination und wurden nicht in Experimenten verwendet. In diesem Manuskript isolierte RPE-Zellen exprimieren RPE65, ein Protein, das in RPE-Zellen stark exprimiert wird (Abbildung 2). Die Bereiche, in denen die RPE65-Expression geringer erscheint, sind wahrscheinlich auf eine Pigmentierung zurückzuführen, die die Fluoreszenz blockiert, da diese Bereiche stärker pigmentierten Zellen entsprechen (Abbildung 2A). Ein weiteres charakteristisches Protein, das von den isolierten RPE-Zellen exprimiert wurde, war VEGF. Nach 10 Tagen wurde VEGF auf der basalen Seite der RPE-Monoschicht mit einer Konzentration von 2612,5 ± 28,0 pg/ml stärker exprimiert als auf der apikalen Seite mit einer Konzentration von 2141,2 ± 53,5 pg/ml (Abbildung 3). Primäre RPE-Zellen von Schweinen weisen auch Mikrovilli- und Kopfsteinpflastermorphologie auf (Abbildung 4). Darüber hinaus stiegen die TEER-Messwerte auf Zellkultureinsätzen von 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 nach 7 Tagen auf 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 nach 14 Tagen (Abbildung 5), was auf eine konsistente, gesunde Bildung von Tight Junctions im Laufe der Zeit hinweist22. Um die Verbindungsbildung weiter zu untersuchen, wurden RPE-Zellen auf die ZO-1-Expression analysiert, die an Zellgrenzen lokalisiert war, was auf eine gesunde Übergangsbildung und Monolayer-Integrität hindeutet (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Primäres RPE nach der Aussaat auf Well-Platten und Subkultivierung. Gesunde RPE-Zellen 3 Tage nach der Isolierung (A), vollständig konfluente Monoschicht 7 Tage nach der Isolierung (B), RPE erfolgreich auf einen Kultureinsatz (C) und Bereiche mit potenzieller zellulärer Kontamination (Pfeile) auf einer RPE-Kultur (D). Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Immunzytochemische Bilder, die die RPE65-Expression in porcinen RPE-Zellen zeigen. Hellfeld (A), RPE65 (B), Kerne (C) und zusammengeführte (D) Bilder von Zellen 15 Tage nach der Aussaat. Beachten Sie, dass der körnige Hintergrund im Hellfeldbild die poröse Kultureinsatzmembran ist. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: VEGF-Expression in apikalen und basalen Seiten der RPE-Monoschicht. Die VEGF-Konzentration wurde durch einen ELISA bestimmt, der nach 10 Tagen Zellwachstum auf Kultureinsätzen durchgeführt wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung mit n = 2 dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahme von primären RPE-Zellen des Schweins. Die Zellen wurden vor der Bildgebung 30 Tage lang gezüchtet. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: TEER-Messwerte an RPE-Zellen, die auf Zellkultureinsätzen kultiviert wurden. Widerstandswerte nach 7, 10 und 14 Tagen Wachstum. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung mit n = 3 dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Immunzytochemische Bilder, die die ZO-1-Expression in porcinen RPE-Zellen zeigen. Hellfeld (A) ZO-1 (B), Kerne (C) und zusammengefügte (D) Bilder von Zellen 6 Tage nach der Aussaat auf Glasbodenplatten. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie RPE-Zellen aus Schweineaugen isoliert werden. Pigmentierung und Kopfsteinpflastermorphologie werden innerhalb von 7 Tagen nach der Isolierung beobachtet (Abbildung 1B). Darüber hinaus deuten die TEER-Daten auf eine Tight-Junction-Bildung22 und eine gesunde Monoschicht hin (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass mit dieser Methode isolierte RPE-Zellen dem menschlichen RPE ähneln und in Netzhautzellkulturmodellen von Vorteil sein können.

Die in diesem Manuskript verwendeten Augen stammen post mortem aus einer örtlichen Metzgerei, könnten aber auch aus anderen Quellen stammen, z. B. aus akademischen Einrichtungen mit Mitarbeitern, die Schweineprodukte verwenden. Es ist wichtig, den Eingriff so schnell wie möglich nach dem Tod des Tieres zu beginnen und die Augen vor dem Eingriff kühl zu halten. Während der Isolierung ist es wichtig, das RPE erst zu stören, wenn es nach der Trypsinisierung verreibt. Diese Sorgfalt ist am kritischsten, wenn die neuronale Netzhaut geschält wird, da mangelnde Vorsicht dazu führen kann, dass die Bruchsche Membran1 mit der Pinzette gegriffen und andere Zelltypen in die Lösung eingebracht werden.

Obwohl dieses Verfahren für unsere Bedingungen optimiert wurde, können einige Änderungen an der Methodik vorgenommen werden. Wenn beispielsweise bestimmte Aussaatdichten gewünscht werden, können Zellen nach der DNase-Inkubation gezählt werden. Wenn die Vakuumabsaugung nicht funktioniert, kann die neuronale Netzhaut durch vorsichtiges Trimmen mit einer kleinen, gebogenen Schere entfernt werden. Bei der Aussaat für Experimente kann eine hohe Aussaatdichte wie 2,5 x 105 Zellen/cm2 verwendet werden, um eine übermäßige Zellteilung zu verhindern. Darüber hinaus wird eine wiederholte Passage nicht empfohlen, da die Zellen beginnen können, ihre nativen Phänotypen zu verlieren. Während in dieser Studie Passage-1-Zellen für Experimente verwendet wurden, könnten möglicherweise zusätzliche Passagen verwendet werden, wenn der RPE-Phänotyp und die RPE-Eigenschaften erhalten bleiben. Schließlich kann auf Wunsch eine Konzentration von 1 % FBS anstelle von 2 % für Subkulturen oder Experimente verwendet werden.

Diese Methode hat einige Nachteile. Erstens ist es schwierig, Alter, Geschlecht, Rasse und Todeszeitpunkt von Tieren zu replizieren oder zu erhalten, was häufige Probleme bei der primären Zellisolierung sind. Zweitens kann eine Übertrypsinisierung schnell zu abnormalen Zellen führen, was auch von Fietz et al.17 festgestellt wurde. Letztendlich bietet diese Methode jedoch eine kostengünstige und effiziente Möglichkeit, primäre RPE-Zellen zu erhalten. Diese Zellen benötigen keine langen Differenzierungszeiten wie iPSCs. Diese Schweine-RPE haben im Gegensatz zu ihren undifferenzierten Gegenstücken auch von Natur aus Schlüsselstrukturen wie Mikrovilli und Pigmentierung15,16. Als solche bieten diese Zellen einen repräsentativeren Zelltyp für Netzhautstudien. Schließlich könnte diese Methode für ländlichere Gebiete oder Institutionen, die keinen Zugang zu menschlichen Spenderaugen haben, sehr vorteilhaft sein, um Netzhautmodelle analog zu menschlichen Modellen herzustellen, um Sehkraft und Krankheit zu verstehen.

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Disclosures

Nichts.

Acknowledgments

Die Autoren danken Farhad Farjood für die Hilfe bei der RPE-Zellkultur und -isolierung von Schweinen und Thomas Harris für die Hilfe bei SEM. Die Autoren danken der Microscopy Core Facility an der Utah State University für die Unterstützung der REM-Analyse. Die Einrichtung unterhält ein Rasterelektronenmikroskop, das durch einen Zuschuss der National Science Foundation Major Research Instrumentation (CMMI-1337932) erworben wurde. Die Finanzierung dieser Studie erfolgte durch ein National Institutes of Health durch Grant 1R15EY028732 (Vargis) und ein BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Zusätzliche Mittel wurden durch einen Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) des Office of Research der Utah State University und einen Seed Grant (Vargis) des Alzheimer's Disease and Dementia Research Center der Utah State University bereitgestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass Cellvis P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% Alfa Aesar L13191.30
Cell Strainer Fisher Scientific  22-363-548 one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific  05-539-12
Cooler, 8 L Igloo 32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts Fisher Scientific  07-200-154 Culture inserts
Cut Resistant Glove Dowellife 712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution Fisher Scientific  SH3026401 for ICC dilutions only 
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate Corning 10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas Sigma Aldrich DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium Cytiva SH3002B.02 stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)  Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS) Avantor 232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder Fisher Scientific  BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem Fisher Scientific  LC146501
Gauze Sponges Fisher Scientific  22-415-504 One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen Thermo Scientific A32728 RPE65 secondary antibody
Ice  Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Fisher Scientific  R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" Cole-Palmer EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide Fisher Scientific  50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm  Corning 430167 one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste 
Povidone-Iondine Solution, 10% Equate 49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen Thermo Scientific MA116578 RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10 Fisher Scientific  22-079-683
Scalpel Handles Style 3 Fisher Scientific  50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26" Fisher Scientific  50-209-1792
Tissue Culture Incubator 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells VWR 10062-892 One for eye wash and one for seeding 
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL Fisher Scientific  14-955-111F
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate Corning 25053Cl
Tweezers Style 20A Fisher Scientific  17-467-231
Tweezers Style 2A Fisher Scientific  50-238-47 for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI Fisher Scientific  17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen Fisher Scientific  33-911-1 ZO-1 conjugated primary antibody

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References

  1. Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
  3. Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
  4. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  5. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  6. Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
  7. Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
  8. Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
  9. Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
  10. Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
  11. Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
  12. Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
  13. Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
  14. Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
  15. Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
  16. Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
  17. Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
  18. Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
  19. Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
  20. Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
  21. Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
  22. Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).

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Biologie Heft 207
Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die <em>In-vitro-Modellierung</em>
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Paterson, C. A., Weatherston, D.,… More

Paterson, C. A., Weatherston, D., Teeples, T., Vargis, E. Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling. J. Vis. Exp. (207), e66079, doi:10.3791/66079 (2024).

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