Summary
Detta protokoll beskriver proceduren för att erhålla och odla primära retinala pigmentepitelceller (RPE) från lokalt framställda grisögon. Dessa celler fungerar som ett högkvalitativt alternativ till stamceller och är lämpliga för in vitro-näthinneforskning.
Abstract
Näthinnans pigmentepitel (RPE) är ett viktigt monolager i den yttre näthinnan som ansvarar för att stödja fotoreceptorer. RPE-degeneration förekommer vanligtvis vid sjukdomar som kännetecknas av progressiv synförlust, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Forskning om AMD förlitar sig ofta på mänskliga donatorögon eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) för att representera RPE. Dessa RPE-källor kräver dock förlängda differentieringsperioder och betydande expertis för odling. Dessutom saknar vissa forskningsinstitutioner, särskilt på landsbygden, enkel tillgång till donatorögon. Även om det finns en kommersiellt tillgänglig immortaliserad RPE-cellinje (ARPE-19), saknar den viktiga RPE-egenskaper in vivo och är inte allmänt accepterad i många oftalmologiska forskningspublikationer. Det finns ett stort behov av att få representativa primära RPE-celler från en mer lättillgänglig och kostnadseffektiv källa. Detta protokoll belyser isolering och subkultur av primära RPE-celler erhållna efter döden från grisögon, som kan köpas lokalt från kommersiella eller akademiska leverantörer. Detta protokoll kräver vanliga material som vanligtvis finns i vävnadsodlingslaboratorier. Resultatet är ett primärt, differentierat och kostnadseffektivt alternativ till iPSCs, mänskliga donatorögon och ARPE-19-celler.
Introduction
Det retinala pigmentepitelet (RPE) är ett monolager som ligger i den yttre näthinnan mellan Bruchs membran och fotoreceptorerna1. RPE-celler bildar täta förbindelser med proteiner som zonula occludens-1 (ZO-1) och har en distinkt fenotyp som kännetecknas av pigmentering och hexagonal morfologi 2,3. Dessa celler bidrar till blod-näthinnebarriären och stöder därigenom fotoreceptorhälsan och upprätthåller retinal homeostas 4,5. Dessutom spelar RPE-celler en avgörande roll för synen genom att absorbera ljus och återvinna viktiga komponenter för fotoreceptorerna6. Till exempel omvandlar RPE65, ett protein som uttrycks i hög grad i RPE-celler, all-trans-retinylestrar till 11-cis-retinol 7,8. Med tanke på de många funktioner som utförs av RPE-celler är deras dysfunktion inblandad i olika sjukdomar, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration och diabetisk retinopati 9,10. För att öka förståelsen för näthinnepatologier och utveckla nya behandlingar används ofta in vitro-modeller av näthinnan.
För att generera representativa modeller av friska eller sjuka näthinnor är det absolut nödvändigt att använda en mimetisk RPE-celltyp. Den kommersiellt tillgängliga ARPE-19-cellinjen saknar naturliga fenotyper, såsom pigmentering, medan iPSCs kan ta månader att differentiera 11,12,13. Även om mänskliga donatorögon kan vara idealiska, är de ofta inte lättillgängliga för många forskningslaboratorier.
Här har vi tagit fram en metod för att använda grisögon, som har många likheter med mänskliga ögon14, för att få fram primära RPE-celler. Dessa primära RPE-celler från svin har använts i flera näthinnemodeller 15,16. Dessa celler är inte bara kostnadseffektiva, utan de kräver också mindre tid att förvärva än iPSC eller donatorögon. Dessutom uppvisar de naturliga egenskaper, såsom pigmentering och mikrovilli. Även om liknande protokoll för RPE-extraktion från svin finns 17,18,19, validerar denna enkla och detaljerade teknik ytterligare enzymatisk dissociation och använder material som vanligtvis finns i de flesta cellodlingslaboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ögonen som används i denna procedur erhålls efter döden från en lokal, USDA-inspekterad slaktare, och inget arbete utförs med levande djur. Efter att djuren har avlivats går det cirka 2 timmar innan ögonen är enuklerade. Eftersom vävnadsförruttnelse kan börja uppstå är det viktigt att hålla ögonen svala under transporten för att förhindra ytterligare karies. Vid denna procedur placeras ögonen omedelbart i ett kylskåp efter enukleation. Därefter placeras påsen med ögon inuti en 1000 ml polypropenbägare och omges av is i en 8 L kylare. Det är viktigt att inte placera ögonen direkt på isen. När ögonen anländer till laboratoriet utförs isoleringen av RPE-cellerna i ett biosäkerhetsskåp. Det är viktigt att slutföra denna process inom 3-5 timmar. Detta protokoll har optimerats för bearbetning av 10 ögon.
1. Beredning av alikvoter för DNase-bestånd
OBS: Det rekommenderas att detta steg utförs före isoleringen.
- Bered en 5 mM kalciumkloridlösning med sterilt avjoniserat vatten.
VARNING: Kalciumkloridpulver kan orsaka allvarlig ögonirritation eller skada. Bär lämplig personlig skyddsutrustning. - Tillsätt 5 mM kalciumkloridlösning till DNase-pulver (se materialtabell) för att få en slutlig DNas-koncentration på 3 mg/ml. Se till att lösningen blandas ordentligt.
VARNING: DNas är en risk för luftvägssensibilisering. Andas inte in pulver/ämne. - Fördela små volymer, t.ex. 1 ml, i mikrocentrifugrör.
- Frys alikvoter vid -20 °C fram till användning.
2. Ställa in dissektionsområdet
- Överför de sterila dissektionsinstrumenten och cellodlingsutrustningen till biosäkerhetsskåpet: kirurgiskt draperi, petriskålar, cellsilar, brunnsplattor, gasväv, pincett, skalpellhandtag, skalpellblad och irissax (se materialförteckning).
- Använd en pincett och lägg ut det kirurgiska draperiet. Placera en 6-hålsplatta ovanpå operationsduken och ta bort locket.
- Placera en alikvot steril Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) på is och in i biosäkerhetsskåpet.
- Fyll en brunn på en 6-hålsplatta halvvägs (ungefär 6 ml) med 10 % povidon-jodlösning.
- Fyll de återstående brunnarna med kylda DPBS.
- Ta av locket från en av petriskålarna och placera den upp och ner ovanpå operationsduken. Ställ petriskålens botten åt sidan som avfallsbehållare.
- Placera en alikvot cellodlingssubstrat (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % antibiotika/antimykotika) och en alikvot på 0,25 % trypsin/EDTA i ett vattenbad vid 37 °C.
- Ta ut DNase-stamlösningen ur frysen (se resten av protokollet för mer information).
3. Avlägsnande av yttre vävnad
OBS: Utvändig vävnadsborttagning kan utföras utanför biosäkerhetsskåpet. Inspektera ögat före skärning för att säkerställa att sclera inte har punkterats, att pupillen inte är dimmig och att synnerven är närvarande. Kassera ögon som inte uppfyller dessa kriterier.
- Medan du håller muskeln fäst vid ögat med ena handen, använd den andra handen för att försiktigt skära bort vävnaden som omger sclera med en skalpell. Var försiktig så att du inte krossar ögat eller råkar skära igenom sklera. Om skleran skärs igenom och exponerar den svarta insidan, kassera ögat.
VARNING: En skärbeständig handske rekommenderas starkt för handen som håller muskeln för att skydda mot oavsiktliga skärsår. - Trimma synnerven med en böjd irissax till en längd av högst 3 mm. Om synnerven är för lång kommer ögonmusslan inte att sitta ordentligt i cellsilen senare.
- Placera ögat på is med hornhinnan nedåt.
- Upprepa steg 3.1-3.3 tills den yttre vävnaden har tagits bort från varje öga.
4. Dissektion av ögat
- Använd en pincett för att överföra ett öga till biosäkerhetsskåpet och in i brunnen som innehåller 10 % povidon-jodlösning och rotera ögat för att säkerställa att det är helt belagt med jodlösningen. För att hålla verktygen så sterila som möjligt bör dessa pincetter endast användas för att röra vid ögats utsida.
- Medan ögat sitter i jodlösning, placera en steril gasväv på det grunda, inverterade locket på petriskålen som tillagats tidigare. Placera en cellsil i en separat petriskål. Använd endast cellsilen för att stödja ögonkoppen, inte för cellseparation.
- Efter att ha låtit ögat sitta i jodlösning i ungefär 30 s, tvätta ögat genom att doppa det i brunnarna som innehåller DPBS i ungefär 5 s vardera, flytta från brunn till brunn för att gradvis späda jodlösningen och överför ögat till den sterila gasväven.
- Gör ett litet snitt med en skalpell under ora serrata, eller ungefär 1/3 ner på jordklotet från iriskanten.
- Efter snittet använder du en irissax för att klippa jämnt längs klotets omkrets, parallellt med hornhinnan. När du manövrerar ögat, använd endast pincetten för att röra vid utsidan av ögat eller gasbindan för att bibehålla steriliteten.
- Använd pincetten för att ta tag i synnerven och lyft försiktigt bort jordgloben från gasbindan. Glaskroppen ska falla ut ur klotet. Om det behövs, skaka försiktigt ögat för att hjälpa till att få bort glaskroppen.
OBS: Om glaskroppen är mycket svår att ta bort, försök att skära lägre på globen. - Placera försiktigt ögonkoppen i den förberedda cellsilen, med ögonkoppens insida uppåt. Om den är ojämn, använd en pincett för att justera ögonmusslan för att få snittet så plant som möjligt.
- Tillsätt försiktigt kyld DPBS i ögonkoppen så att vätskenivån är precis under snittets lägsta punkt. Denna DPBS kommer att tas bort efter borttagning av neural näthinna.
OBS: Volymen av DPBS som läggs till kommer att variera beroende på ögonstorlek och snittplats. - Upprepa steg 4.1-4.8 tills alla ögon är dissekerade.
5. Borttagning av neural näthinna och RPE-dissociation
OBS: Följande avsnitt är lättare att utföra i etapper. I denna uppsättning utförs denna process på en sats (vanligtvis 3 ögonmusslor) åt gången. För steg 5.1-5.7 bör varje steg utföras på hela batchen innan du går vidare till nästa steg.
- Under en ficklampa, hitta alla områden där den neurala näthinnan (vit/rosa) börjar lossna från RPE (svart). Använd sedan en trubbig pincett för att försiktigt ta tag i den lyfta neurala näthinnan och dra bort den.
OBS: Om det inte finns några områden där den neurala näthinnan lossnar, använd pincetten för att försiktigt ta tag i den nära toppen av ögonkoppen. Med denna metod, om RPE/åderhinnan skadas, kommer dessa celler inte att dissocieras under RPE-insamlingen. - Samla försiktigt upp den neurala näthinnan nära den optiska skivan.
- Aspirera ut den neurala näthinnan med hjälp av en Pasteur-pipett som är ansluten till ett vakuumaspirationssystem. Det rekommenderas att fjädra ambitionen för att hjälpa till i borttagningsprocessen.
OBS: En pipettspets kan placeras på änden av en Pasteur-pipett för att minska suget. - Tillsätt försiktigt ytterligare kylda DPBS för att ersätta det som aspirerades.
- Ta bort kvarvarande neural näthinna genom att aspirera en gång till. Den här gången tar du bort så mycket DPBS som möjligt utan att störa den exponerade RPE.
- Tillsätt försiktigt trypsin i ögonkoppen. Håll volymnivån under snittlinjen och eventuella delar av skadad RPE för att minska kontaminering.
VARNING: Trypsin är ett enzym som orsakar hud- och ögonirritation vid kontakt. Bär lämplig personlig skyddsutrustning. - Efter att trypsin har tillsatts i varje öga, se till att petriskålens lock sätts tillbaka. Överför sedan petriskålen till en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 minuter.
- Upprepa steg 5.1-5.7 för varje sats tills alla ögonmusslor har behandlats.
6. RPE-insamling
- Samla RPE-cellerna från varje sats ögon (2-3 ögon) och placera dem i ett enda 15 ml centrifugrör för att göra såddprocessen enkel.
- Under en ficklampa, triturera försiktigt med en 1000 μL pipett för att lossa RPE-cellerna. Om RPE-cellerna inte lossnar, tillsätt färskt trypsin och inkubera i ytterligare 10-15 minuter. Var försiktig så att du inte skrapar på näthinnan.
- Samla RPE-cellerna i ett 15 ml centrifugrör.
- Tvätta ögonkoppen med cellodlingsmedia för att samla upp eventuella kvarvarande celler och neutralisera trypsinet. Se till att det finns minst dubbelt så mycket media som trypsin i 15 ml centrifugröret.
- Upprepa steg 6.1 tills RPE-celler har samlats in från alla ögonmusslor.
- Centrifugera cellsuspensionerna vid 250 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
7. Förbereda DNase-arbetslösning
- Beräkna den volym 3 mg/ml DNas-stamlösning (beredd i steg 1) som behövs för att tillsätta till cellodlingssubstrat för en slutlig koncentration på 100 μg/ml och en slutlig volym på 3 ml per cellrör (dvs. för tre centrifugrör med celler krävs 9 ml 100 μg/ml DNaslösning).
- Kombinera lämpliga volymer av DNase-stamlösning och cellodlingsmedia. Att använda DNase i arbetslösningen hjälper till att förhindra cellklumpning och gör att cellerna kan sås jämnt.
8. Sådd av RPE-celler
- Efter centrifugering i steg 6.3, avlägsna supernatanter från varje 15 ml centrifugrör, var noga med att inte störa cellpelleten.
- Återsuspendera varje cellpellet i 3 ml DNase-arbetslösning.
- Placera centrifugrören på 15 ml som innehåller de återsuspenderade cellerna i en befuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 i 15 minuter.
- Efter inkubationen centrifugeras cellsuspensionerna vid 150 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanterna, var noga med att inte störa cellpelletsen.
- Återsuspendera varje cellpellet i 3 ml färskt cellodlingsmedium.
- För varje centrifugrör som innehåller 2-3 ögon RPE-celler, så en brunn av en 6-hålsplatta (passage 0).
- Överför försiktigt den sådda 6-hålsplattan till en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 .
9. Primär RPE-cellodling från svin
- Låt de nysådda RPE-cellerna fästa i 48-72 timmar innan du flyttar plattan. Under det första mediebytet kan en tvätt med färska cellodlingsmedier utföras för att hjälpa till att ta bort överflödigt cellskräp.
- Byt ut cellodlingsmediet var 48:e timme.
- När cellerna når sammanflöde, övergå till ett cellodlingsmedium med en FBS-koncentration på 2 % och behåll tills experiment.
10. Validering av RPE-celler
- Immunocytokemisk (ICC) färgning
- Fixera celler i 4% formaldehyd i DPBS i 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta två gånger med DPBS.
- Permeabilisera celler (om det behövs) med 0,2 % Triton-X 100 i DPBS i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta två gånger med DPBS.
- Applicera blockerande lösning av 3 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i DPBS i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tillsätt primär antikropp vid spädning 1:100 (eller rekommenderad tillverkarkoncentration) (se materialtabell) och låt stå i 1 timme i rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Tvätta tre gånger med DPBS i 5 min vardera.
- Tillsätt sekundär antikropp (om det behövs) vid 2 μg/ml (eller rekommenderad tillverkarkoncentration) (se materialtabell) och låt stå i 1 timme i rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med DPBS i 5 minuter vardera om sekundär antikropp appliceras.
- Tillsätt nukleär färgsond vid tillverkarens koncentration (se materialtabell) och låt sitta i 25 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med PBS i 5 min vardera.
- Om du är på en cellodlingsinsats, montera den på objektglaset med ett täckglas med hjälp av monteringsmedium enligt beskrivningen av Rickabaugh och Weatherston et al.20. Annars bildceller i DPBS.
- Svepelektronmikroskopi (SEM)
- Följ proceduren som beskrivs av Harris et al.21.
- Transepitelial elektrisk resistans (TEER)
- Följ tillverkarens protokoll för TEER-mätning (se materialtabell) med 1 ml odlingsmedium i basalkammaren15.
- Enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA)
- Utför ELISA15 med hjälp av ett multiplex humant enzymkopplat immunadsorberande analyskit enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av denna procedur isolerades primära RPE-celler framgångsrikt från grisögon. Figur 1A visar RPE-celler 3 dagar efter isolering med karakteristisk pigmentering. Efter 1 veckas tillväxt var cellerna helt sammanflytande och bildade ett friskt monolager (Figur 1B). Cellerna överfördes sedan till cellodlingsinsatser där de bibehöll sin pigmentering och morfologi (Figur 1C), vilket ytterligare stöder isoleringsprocedurens effektivitet. Odlingar som inte uppvisade dessa egenskaper och istället uppvisade variationsmorfologi och överdriven pigmentering (Figur 1D) misstänktes för cellulär kontamination och användes inte i experiment. RPE-celler som isolerats i detta manuskript uttrycker RPE65, ett protein som uttrycks i hög grad i RPE-celler (Figur 2). De områden där RPE65-uttrycket verkar lägre beror sannolikt på att pigmentering blockerar fluorescensen, eftersom dessa områden motsvarar mer kraftigt pigmenterade celler (figur 2A). Ett annat karakteristiskt protein som uttrycktes av de isolerade RPE-cellerna var VEGF. Efter 10 dagar uttrycktes VEGF mer på den basala sidan av RPE-monolagret med en koncentration på 2612,5 ± 28,0 pg/ml jämfört med den apikala sidan med en koncentration på 2141,2 ± 53,5 pg/ml (Figur 3). Primära RPE-celler från svin har också mikrovilli och kullerstensmorfologi (figur 4). Dessutom, när de odlades på cellodlingsinsatser, ökade TEER-avläsningarna från 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 vid 7 dagar till 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 efter 14 dagar (Figur 5), vilket indikerar konsekvent, hälsosam tight junction-bildning över tid22. För att ytterligare undersöka korsningsbildning analyserades RPE-celler för ZO-1-uttryck, som lokaliserades till cellgränser, vilket tyder på hälsosam korsningsbildning och monolagerintegritet (Figur 6).
Figur 1: Primär RPE efter att ha sådts på brunnsplattor och subkultiverats. Friska RPE-celler 3 dagar efter isolering (A), helt sammanflytande monolager 7 dagar efter isolering (B), RPE framgångsrikt passage till en odlingsinsats (C) och områden med potentiell cellulär kontaminering (pilar) på en RPE-kultur (D). Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Immunocytokemiska bilder som visar RPE65-uttryck i grisiga RPE-celler. Brightfield (A), RPE65 (B), kärnor (C) och sammanslagna (D) bilder av celler 15 dagar efter sådd. Observera att den korniga bakgrunden i ljusfältsbilden är det porösa kulturinsatsmembranet. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: VEGF-uttryck i apikala och basala sidor av RPE-monolagret. VEGF-koncentrationen bestämdes genom ett ELISA utfört efter 10 dagars celltillväxt på odlingsinsatser. Felstaplar representerar standardavvikelsen med n = 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Svepelektronmikroskopibild (SEM) av primära gris-RPE-celler. Cellerna odlades i 30 dagar före avbildning. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: TEER-avläsningar utförda på RPE-celler odlade på cellodlingsinsatser. Motståndsvärden efter 7, 10 och 14 dagars tillväxt. Felstaplar representerar standardavvikelsen med n = 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Immunocytokemiska bilder som visar ZO-1-uttryck i grisiga RPE-celler. Brightfield (A) ZO-1 (B), kärnor (C) och sammanslagna (D) bilder av celler 6 dagar efter sådd på brunnsplattor med glasbotten. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man isolerar RPE-celler från grisögon. Pigmentering och kullerstensmorfologi ses inom 7 dagar efter isolering (Figur 1B). Dessutom tyder TEER-data på att det bildas en tät korsning22 och ett friskt monolager (figur 5). Dessa resultat visar att RPE-celler som isolerats med denna metod liknar human RPE och kan vara till nytta i retinala cellodlingsmodeller.
Ögonen som används i detta manuskript är erhållna från obduktionen från en lokal slaktare, men kan också erhållas från andra källor, till exempel akademiska miljöer med samarbetspartners som använder svinprodukter. Det är viktigt att påbörja ingreppet så snart som möjligt efter att djuret dött och att hålla ögonen svala före ingreppet. Under isoleringen är det viktigt att inte störa RPE förrän triturering efter trypsinisering. Denna försiktighet är mest kritisk vid skalning av den neurala näthinnan, eftersom bristande försiktighet kan leda till att man tar tag i Bruchs membran1 med pincetten och introducerar andra celltyper i lösningen.
Även om denna procedur har optimerats för våra förhållanden kan vissa ändringar göras i metodiken. Till exempel, om specifika såddtätheter önskas, kan celler räknas efter DNase-inkubationen. Dessutom, om vakuumaspiration inte fungerar, kan den neurala näthinnan avlägsnas genom att försiktigt trimma med en liten, böjd sax. Vid sådd för experiment kan en hög såddtäthet såsom 2,5 x 105 celler/cm2 användas för att förhindra överskott av celldelning. Dessutom rekommenderas inte upprepad passage eftersom cellerna kan börja förlora sina naturliga fenotyper. Även om denna studie har använt passage 1-celler för experiment, kan ytterligare passager potentiellt användas om RPE-fenotyp och egenskaper bibehålls. Slutligen kan en koncentration på 1 % FBS användas för subkultur eller experiment istället för 2 %, om så önskas.
Det finns några nackdelar med denna metod. För det första är det svårt att replikera eller få fram djurens ålder, kön, ras och dödstid, vilket är vanliga problem vid primär cellisolering. För det andra kan övertrypsinisering snabbt resultera i onormala celler, vilket också har noterats av Fietz et al17. Men i slutändan erbjuder denna metod ett billigt och effektivt sätt att få primära RPE-celler. Dessa celler kräver inte långa differentieringstider som iPSC. Dessa grisar har också medfödda nyckelstrukturer, som mikrovilli och pigmentering15,16, till skillnad från sina icke-differentierade motsvarigheter. Som sådana erbjuder dessa celler en mer representativ celltyp för näthinnestudier. Slutligen kan denna metod vara mycket fördelaktig för mer landsbygdsområden eller institutioner som inte har tillgång till mänskliga donatorögon för att producera näthinnemodeller analoga med mänskliga modeller för att förstå syn och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Farhad Farjood för hjälp med grisodling och isolering av RPE-celler och Thomas Harris för hjälp med SEM. Författarna erkänner stödet från Microscopy Core Facility vid Utah State University för SEM-analysen. Anläggningen har ett svepelektronmikroskop som förvärvats genom ett National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Finansieringen av denna studie tillhandahölls av ett National Institutes of Health genom anslag 1R15EY028732 (Vargis) och ett BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Ytterligare finansiering tillhandahölls av ett stipendium för grundutbildning och kreativa möjligheter (Weatherston) från Utah State Universitys forskningskontor och ett såddbidrag (Vargis) från Utah State Universitys forskningscenter för Alzheimers sjukdom och demens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
