Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הערכת רגישות מבנית של אזורים לא מסודרים במהותם בתגובה לעקה היפראוסמוטית בתאים חיים באמצעות FRET

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66275
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

אזורים לא מסודרים מהותיים (IDR) הם תחומי חלבון גמישים המשנים את הקונפורמציה שלהם בתגובה לשינויים סביבתיים. Ensemble Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) יכול להעריך את ממדי החלבונים בתנאים שונים. אנו מציגים גישת FRET להערכת רגישות מבנית IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים תחת לחץ היפראוסמוטי.

Abstract

אזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) הם תחומים חלבוניים המשתתפים בתהליכים תאיים חיוניים. במהלך תנאי עקה, התכונות הפיזיקוכימיות של הסביבה התאית משתנות, ומשפיעות ישירות על ההרכב הקונפורמטיבי של IDRs. IDR רגישים מטבעם להפרעות סביבתיות. חקר האופן שבו התכונות הפיזיקוכימיות של התא מווסתות את ההרכב הקונפורמטיבי של IDR חיוני להבנת הבקרה הסביבתית של תפקודם. במאמר זה אנו מתארים שיטה שלב אחר שלב למדידת הרגישות המבנית של IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים בתגובה לתנאי עקה היפראוסמוטיים. אנו מציגים את השימוש בהעברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי להעריך כיצד הממדים הגלובליים של IDR משתנים במהלך עלייה הדרגתית של לחץ היפראוסמוטי המוטל על תאים עם אוסמוליט כלשהו. בנוסף, אנו מספקים סקריפט לעיבוד מדידות פלואורסצנטיות והשוואת רגישות מבנית עבור IDR שונים. על ידי ביצוע שיטה זו, חוקרים יכולים לקבל תובנות חשובות לגבי השינויים הקונפורמטיביים שעוברים IDR בסביבה התוך-תאית המורכבת בסביבות משתנות.

Introduction

אזורים בעלי אי-סדר פנימי (IDR) הם מרכיבים קריטיים בתהליכים תאיים1. בשילוב עם תחומים מובנים, IDR חיוניים לתפקודי חלבון. הרכב חומצות האמינו של IDR מוטה, ומיוצג בעיקר על ידי שאריות טעונות, הידרופיליות וקטנות. בגלל מאפיין זה, IDR נחשבים לתחומים בעלי מורכבות נמוכה 2,3. IDR רבים משכו תשומת לב, בעיקר משום שאזורים אלה ממלאים תפקיד מכריע במצבים פתולוגיים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות. מחלות כאלה מאופיינות על ידי הרכבה עצמית ולאחר מכן תצהיר חוץ תאי או תוך תאי של IDR בנוירונים4. דוגמאות ל-IDR כאלה כוללות β עמילואיד (Aβ) במחלת אלצהיימר, הנטינגטין (HTT) במחלת הנטינגטון, וחלבון קושר דנ"א-TAR -43 (TDP-43) והתמזגו בסרקומה (FUS) בטרשת אמיוטרופית צידית ודמנציה פרונטוטמפורלית4. המחקר של סידורים מבניים מחדש של IDR בהקשר של מחלה השתפר באופן משמעותי על ידי שיטות ספקטרוסקופיות, כולל העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET).

האופי ההידרופילי והמורחב של IDR הופך אותם לרגישים ביותר לשינויים בתכונות הפיזיקוכימיות של סביבת התמיסה5. המידה שבה ההרכב הקונפורמטיבי של IDR משתנה על ידי הסביבה נקראת רגישות מבנית 5,6,7. ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי לחקור את הקונפורמציה והדינמיקה של IDR, כולל דיכרואיזם מעגלי (CD) ופיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS)8,9. למרבה הצער, CD ו- SAXS דורשים כמויות גדולות של חלבונים מטוהרים, ולכן הם אינם מתאימים למחקרים בתאים. לעומת זאת, FRET היא טכניקה המודדת את עוצמת הפלואורסצנטיות של שתי מולקולות פלואורסצנטיות המסמנות באופן ספציפי IDR אחד, כלומר ניתן לנטר אותן בתערובות מורכבות כגון תאים חיים10. מדידה דינמית של הרגישות המבנית של IDR בתאים חיים נחוצה להבנת האופן שבו הסביבה מווסתת את הקונפורמציה והתפקוד של הפרוטאום הלא מסודר.

FRET היא שיטה רבת עוצמה לכימות הרגישות המבנית של IDRs, כמו גם חלבונים כדוריים ורב-תחומיים בתאים חיים. השיטה דורשת מבנה המורכב מ-IDR של עניין הדחוק בין שני חלבונים פלואורסצנטיים (FP), המכונה זוג FET. עבור פרוטוקול זה, אנו מציעים להשתמש ב- mCerulean3 כ- FP התורם ובסיטרין כ- FP המקבל, בגלל הטווח הדינמי הגדול שלהם, בהשוואה ל- FPs אחרים שדווחו במחקר קודם על רגישות IDR6. FRET נוצל בעבר למדידת הרגישות המבנית של צמח בהקשרים תאיים שונים6. בנוסף, טכניקה זו שימשה לאפיון ממדי החלבון הכוללים של IDR על ידי קבוצות מחקר שונות הן in vitro והן in vivo 5,11.

במאמר זה נתאר את שיטת FRET לחקר הרגישות המבנית של IDR בתאי שמרים חיים (Saccharomyces cerevisiae). אנו מציגים תוצאות מייצגות המבוססות על מפעל IDR בשם AtLEA4-5. AtLEA4-5 אינו מסודר בתמיסה, אך מתקפל לתוך סליל α כאשר נוצרת צפיפות מקרומולקולרית במבחנה12. AtLEA4-5 הוא מודל ייחוס טוב לשיטה זו מכיוון שהוא קטן יחסית (158 שאריות), לא מסודר ורגיש להפרעות סביבתיות כפי שדווח בסיליקו ובמבחנה 6,12. השיטה המוצגת כאן ניתנת להרחבה עבור גישות תפוקה גבוהה מכיוון שקל לגדל תאי שמרים, והטיפול מיושם בכמויות קטנות. בנוסף, שינויים קטנים בפרוטוקול יכולים להיות מיושמים על מערכות תאיות אחרות כגון חיידקים ותאי צמח6. הפרוטוקול יכול להתבצע בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית עם גישה לקורא מיקרו-צלחות עם מצב פלואורסצנטי, ציוד הזמין ברוב מוסדות המחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מבנה פלסמיד

  1. הגבר את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) המקודדת עבור IDR הרצוי על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). אל תכלול את קודון העצירה מכיוון שה- ORF יהיה מוקף בגנים המקודדים את החלבונים הפלואורסצנטיים. עבור ההגברה, עצבו פריימרים עם אתרי הגבלה SacI (5') ו-BglII (3').
    הערה: עבור מקטע התוצאות המייצגות, השתמשנו ב- AtLEA4-5 כ- IDR שנבחר. הגברנו את ORF של AtLEA4-5 מפלסמיד pTrc99A-AtLEA4-512.
  2. לעכל את מוצר ORF PCR על ידי הגבלה רצופה עם האנזימים SacI ו - BglII13.
  3. השג את הפלסמיד המסחרי pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) מ- Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
  4. בצע הגבלה רצופה באמצעות האנזימים SacI ו- BglII כדי להסיר את AtLEA4-5 ORF מהפלסמיד pDRFLIP38-AtLEA4-5, תוך השארת פלסמיד פתוח המכיל את זוג FRET13.
  5. לטהר את קטעי הדנ"א המעוכלים באמצעות שחזור ג'ל מאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז14. קשר את המקטעים המוגבלים באמצעות ליגאז DNA15.
  6. הפוך את תגובת השיבוט לתאי Escherichia coli מוכשרים (DH5α או זנים קשורים) ובחר בלוחות Luria-Bertani (LB) המכילים 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין16. לגדול בן לילה (ON) ב 37 °C.
  7. בודד וגדל לפחות חמש מושבות שעברו טרנספורמציה בלוח וגנוטיפ חדשים על ידי PCR17. לטהר את הדנ"א של פלסמיד ממושבה שעברה טרנספורמציה חיובית בשיטות מיני-הכנה סטנדרטיות18.
  8. אמת את המיצוי והשלמות של DNA פלסמיד באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose19. ודא את השכפול הנכון של המבנה באמצעות ריצוף Sanger20.

2. ביטוי פלסמיד בתאי שמרים

הערה: השתמש בטכניקות אספטיות סטנדרטיות כדי לבצע את השלבים הבאים. השתמשו במכסה מנוע למינרי של תרבית או במצית.

  1. יש לחסן פס של זן S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) ל-3 מ"ל של שמרים פפטון דקסטרוז (YPD) בינוני ולגדול ב-30°C וב-200 סל"ד.
    הערה: BJ5465 הוא זן חסר פרוטאז (CH1) המומלץ לעבודה עם IDR. ניתן לבדוק זנים אחרים של S. cerevisiae ולהשתמש בהם.
  2. צנטריפוגה 1 מ"ל של תרבית שמרים רוויה בלילה (OD600 ~ 3-4) ב 14,000 x גרם למשך דקה אחת. בזהירות להסיר את supernatant על ידי pipetting.
  3. השהה מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל של חיץ Tris-EDTA (TE) (pH 7.5) על ידי תנועה עדינה של הצינור. צנטריפוגה ב 14,000 x גרם למשך דקה אחת ובזהירות להסיר את supernatant.
  4. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ עצמות עצלות (40% עם PEG 3,350; 100 מ"מ ליתיום אצטט; 10 מ"מ Tris-HCl; 1 מ"מ EDTA; pH 7.5) על ידי פיפטינג. הוסף 25 μL של DNA זרע סלמון מבושל (100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן התקרר על קרח למשך 5 דקות) DNA של זרע סלמון (2 מ"ג / מ"ל) לתאי השמרים המרחפים מחדש.
  5. הוסף 100 ng של DNA פלסמיד לתערובת ולערבב את התערובת במשך 1 דקות כדי להבטיח ערבוב יסודי. הניחו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות.
  6. מחממים את תערובת השמרים בחום של 42°C למשך 12 דקות, ואז מצננים על קרח למשך 12 דקות נוספות. צנטריפוגה את הצינור ב 14 000 x גרם במשך 1 דקות בזהירות להסיר את supernatant.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של חיץ TE (pH 7.5). צלחת 100 μL של התאים שעברו טרנספורמציה על שמרים Synthetic Dropout Medium ללא לוחות אורציל (SD-ura) בתוספת אגר 15 גרם / ליטר.
  8. דגרו על צלחות בטמפרטורה של 30°C במשך 2-3 ימים (איור 1). פזרו לפחות חמישה שנאי שמרים בצלחת חדשה וגדלו הלאה.

3. אימות של טרנספורמנטים שמרים

  1. בחר חלק קטן מכל מועמד טרנספורמציה על ידי גירוד עדין והשעיה מחדש ב 5 μL של 20 mM NaOH לתוך צינורות PCR בודדים.
  2. חממו את הדגימה בטמפרטורה של 99°C למשך 10 דקות במחזור תרמי כדי לשכב את התאים ולשחרר את הדנ"א לתמיסה. שלב זה חיוני להכנת תבנית ה- DNA עבור PCR.
  3. העבר 1 μL של הדגימה המבושלת לתערובת תגובת PCR נפרדת המכילה את הפריימרים המתאימים ריאגנטים PCR עבור genotyping. השתמשנו בפריימרים הבאים: פריימר קדמי: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. פריימר הפוך: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
  4. הגדר תגובת PCR ואמת את נוכחותו של הפלסמיד הנכון באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. בחר טרנספורמנט אחד לניסויים נוספים.

4. הכנת תרבית תאי שמרים לבדיקת FRET

  1. חסן פס של שמרים שנבחרו טרנספורמציה לתוך 3 מ"ל של נוזל 1x SD-Ura בינוני.
    הערה: בצע הליך זה במכסה מנוע זרימה למינרית ובחומר סטרילי.
  2. גדל ב 30 ° C, 200 סל"ד לפחות 12 שעות כדי להגיע לרוויה. מדוד את OD600. הצמיחה צריכה ליפול בין OD600 = 1.0-2.0.
    הערה: אם OD600 נמוך מ- 1.0, תן לתאים זמן דגירה רב יותר לגדול. אם OD600 חורג מ- 2.0, אל תמשיך והפעל מחדש משלב 4.1.

5. הכנת תאי שמרים לבדיקת FRET

  1. אספו 2 מ"ל של תרבית שמרים וצנטריפוגה למשך הלילה במהירות של 14,000 x גרם בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant על ידי pipetting.
  2. להשהות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של 50 mM 2-(N-Morpholino) חומצה ethanesulfonic (MES) חיץ (pH 6).
  3. צנטריפוגה ב 14,000 x גרם בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant.
  4. חזור על שלבים 5.2 ו- 5.3. להשהות תאי שמרים ב 2 מ"ל של מאגר MES, pH 6 ולשפוך את נפח לתוך מאגר מגיב.

6. הגדרת מדידות הפלואורסצנטיות

הערה: הסריקה הנוכחית נחשבת לביצוע בקורא microplate עם מצב פלואורסצנטי.

  1. עבור הגדרות בסיסיות, הגדר את המכשיר באופן הבא: סוג מדידה: ספקטרום עוצמת פלואורסצנטיות (FI); שם צלחת מיקרו: גריינר 96 F-bottom.
  2. עבור הגדרות אופטיות, הגדר את המכשיר באופן הבא: לא. של נקודות סריקה באורך גל: 91; אורך גל עירור: 433 ננומטר; רוחב פס עירור: 10 ננומטר; אורך גל פליטה: 460 - 550; רוחב צעד: 1 ננומטר; רוחב פס פליטה: 10 ננומטר; גובה מוקד המתקבל על ידי מיקוד אוטומטי; גובה מוקד: 5 מ"מ; אורך גל המשמש לרווח: 490 ננומטר.
  3. עבור הגדרות כלליות, הגדר את המכשיר באופן הבא: זמן התייצבות: 0.1 שניות; כיוון קריאה: חד כיווני, אופקי משמאל לימין, מלמעלה למטה.
    הערה: יש להתאים את הרווח שהוזן ידנית עבור כל מדידה באמצעות הבאר הצפויה להציג את רמות עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהות ביותר לאורך כל סריקת אורך הגל.

7. הכנת תמיסות היפרטוניות ומדידות פלואורסצנטיות

  1. הכינו תמיסות של 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1 M, 1.5 M ו- 2 M NaCl בלוח שחור 96 בארות עם תחתית ברורה. הנפח הסופי בכל באר יהיה 200 μL (150 μL של תמיסת אוסמוליטים + 50 μL של תרחיף תאי שמרים).
    הערה: ניתן להשתמש באוסמוליטים אחרים כדי לגרום ללחץ היפראוסמוטי. כל הפתרונות חייבים להיות מוכנים ב 50 mM MES חיץ pH 6.
  2. עומס 150 μL של 50 mM מאגר MES, pH 6 בשלוש הבארות הראשונות של שורה A (A1, A2, A3) ובבארות הבאות, הוסף 150 μL של התמיסה המתאימה בסדר עולה משמאל לימין (איור 2). כדי לבדוק את כל הריכוזים המוצעים, המשך את העומס בשורה B.
    הערה: הגדרה זו מתחשבת במידות של 3 עותקים טכניים משוכפלים עבור כל ריכוז.
  3. השתמשו במיקרופיפטה בת 12 ערוצים כדי להעביר 50 מיקרוליטר של תאי שמרים שטופים לכל באר. תאי שמרים נוטים למשקעים לתחתית המאגר. הקפד להשהות מחדש את תרחיף השמרים ביסודיות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפני העברת התאים.
  4. יש להעמיס תאים לתוך צלחת 96 בארות המכילה את התמיסות השונות ולערבב היטב על ידי זינוק למעלה ולמטה לפחות פי 4.
  5. מדוד את ספקטרום הפליטה של עוצמת הפלואורסצנטיות באופן מיידי עבור הבארות הרצויות בקורא מיקרו-צלחות עם הגדרות המפרט של שלב 6. חזור על ההליך עבור כל IDR להיבדק בבדיקת FET.
  6. שלב אופציונלי. אם זמין, מדוד מבנה לתורם בלבד (pDRFLIP38-mCerulean3) בהתאם לשלבים המתוארים כאן.
    הערה: מומלץ לבצע שלב זה כדי לחשב את יעילות FRET של כל תנאי. אם הקורא אינו יכול לבצע שלב זה, ניתן לחשב FRET באמצעות שיטת יחס FET. שתי השיטות לחישובי FRET מוסברות בשלבים 8 ו- 9.
  7. בצע לפחות שלושה עותקים משוכפלים בשלושה ימים עצמאיים עבור כל מבנה.

8. עיבוד נתונים בשיטת יעילות FRET

הערה: עבור קוראים בעלי ידע בשפת התכנות R, אנו מספקים קבוצה של סקריפטים R לביצוע עיבוד נתונים המתואר בסעיף זה. סקריפטים ניתן למצוא ב https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. בצע את ההוראות בקובץ README.

  1. יצא נתונים כקובצי .xlsx מקורא המיקרו-לוחות.
  2. נרמל ערכי עוצמת פלואורסצנטיות בכל אורך גל סריקה לנקודה האיזוסבסטית של זוג FRET בשימוש.
    הערה: שלב זה הכרחי להשוואת הספקטרום של כל התנאים שנבדקו. הנקודה האיזוסבסטית של mCerulean3 וזוג Citrine FRET היא 515 ננומטר. לדוגמה, קבל את היחס בין ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות של 460 ננומטר/515 ננומטר, 461 ננומטר/515 ננומטר, 462 ננומטר/515 ננומטר וכן הלאה.
  3. חשב את הממוצע עבור כל שכפול טכני לאחר נורמליזציה של ערכי הפלואורסצנטיות. בסך הכל, צריך להיות עמודה עבור כל מצב של מתח hyperosmotic.
  4. דמיינו את כל ספקטרום עוצמת הפלואורסצנטיות באותה עלילה (איור 3). כל ספקטרום צריך להציג שילוב של ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של mCerulean3 ו-Citrine בודדים. במקרים נדירים, בהם יעילות FRET היא 0, ייצפה רק ספקטרום הפלואורסצנטיות של התורם, או כאשר יעילות FRET היא 1, תיצפה רק פלואורסצנטיות מקבלת. שיא הפליטה הפלואורסצנטית עבור mCerulean3 (תורם) הוא 475 ננומטר, ושיא הפליטה הפלואורסצנטית עבור סיטרין (מקבל) הוא 525 ננומטר.
  5. קבע אם מדידת הפלואורסצנטיות מציגה שינוי FRET טיפוסי בתגובה ללחץ היפראוסמוטי. אם הקונפורמציה של IDR רגישה לטיפול, הדבר יבוא לידי ביטוי כשינוי ביעילות ה- FET. שינוי אופייני ביעילות FRET ישלב ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות של התורם עם עלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של המקבל או להיפך.
  6. כמת את יעילות FRET (EFRET). השג את ערכי השיא המנורמלים של התורם (mCerulean3) (475 ננומטר/515 ננומטר) עבור מבנה IDR ואת המבנה לתורם בלבד עבור כל מצב של לחץ היפראוסמוטי. השתמש בערכי השיא המנורמלים הממוצעים של העותקים הטכניים. בצע פעולה זו עבור כל אחד משלושת העותקים המשוכפלים הבלתי תלויים. חשב EFRET עם הנוסחה הבאה:
    Equation 1
    כאשר IDA הוא היחס 475 ננומטר / 515 ננומטר ממבנה IDR (מבנה זוג FRET), ו- ID הוא היחס 475 ננומטר / 515 ננומטר מהמבנה התורם בלבד.
  7. השווה בין יעילות FET. נרמל את ערכי EFRET של כל תנאי לחץ היפראוסמוטי ל- EFRET של מצב שאינו לחץ (לדוגמה, 0 M NaCl). בצע השוואות באמצעות התוויית תיבה או התוויית עקומה חלקה. בצע ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן סטטיסטי טוקי פוסט-הוק (ערכי p: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

9. עיבוד נתונים בשיטת יחס FRET

הערה: אם לא ניתן להשיג מדידות מתורם בלבד, בצע את שיטת יחס FET. שיטה זו משווה את יחס FRET בין תנאי העקה ההיפראוסמוטיים השונים. יש לבצע את שלבים 7.1 עד 7.5 לפני השלבים בסעיף זה כדי לאמת התנהגות FRET טיפוסית. עבור קוראים בעלי ידע בשפת התכנות R, אנו מספקים קבוצה של סקריפטים R לביצוע עיבוד נתונים המתואר בסעיף זה. סקריפטים ניתן למצוא ב https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. בצע את ההוראות בקובץ README.

  1. חלץ נתונים ב- 475 ננומטר וב- 525 ננומטר מקובץ xlsx שיוצא בעבר מקורא המיקרו-לוחות. ערכים אלה תואמים לשיא הפלואורסצנטיות עבור mCerulean3 (תורם, DxDm) ולשיא הפלואורסצנטיות עבור סיטרין (מקבל, DxAm) כאשר פלואורופור התורם מעורר (433 ננומטר).
  2. נרמל ערכי עוצמת פלואורסצנטיות ב- 475 ננומטר ו- 525 ננומטר לנקודה האיזוסבסטית של זוג FRET בשימוש. הנקודה האיזוסבסטית של mCerulean3 וזוג Citrine FRET היא 515 ננומטר. השג את יחס FRET (DxAm/DxDm).
  3. השווה יחסי FET. נרמל את ערכי DxAm/DxDm של כל תנאי לחץ היפראוסמוטי לממוצע DxAm/DxDm של מצב אי-לחץ (לדוגמה, 0 M NaCl). ערכו השוואות באמצעות התוויית תיבה או התוויית עקומה חלקה (איור 4 ואיור 5). בצע ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן סטטיסטי טוקי פוסט-הוק (ערכי p: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר התמרת תאי שמרים עם פלסמיד pDRFLIP38-AtLEA4-5, נצפתה הפלואורסצנטיות של הטרנספורמנטים החיוביים באמצעות טרנסילטור אור כחול ומסנן (איור 1). הכנת הפתרונות השונים לגרימת עקה היפראוסמוטית גוזלת זמן, ולכן אנו מציעים לעקוב אחר תבנית 96 הקידוחים באיור 2. מיד לאחר הטיפול בעקה היפראוסמוטית בריכוזים משתנים של נתרן כלורי, נרכש ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית (איור 3). ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של כל מצב התקבל כדי לאמת התנהגות שינוי FRET טיפוסית. נורמליזציה של ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות לנקודה האיזוסבסטית נדרשת כדי לתקן טעויות ניסוי. לקבלת תוצאות מייצגות אלה, בדקנו את AtLEA4-5 שדווח בעבר, שהוא צמח רגיש ביותר IDR6. לשם השוואה, בדקנו גם את החלבון הכדורי ABP מעט לא רגיש (איור 3). ניתן לראות כי שני המבנים מציגים שילוב של mCerulean3 וספקטרום פליטת סיטרין (שיאים עבור FPs התורם והמקבל), דבר המצביע על מידה מסוימת של יעילות FRET בסיסית בתנאים סטנדרטיים (0 M NaCl). עבור AtLEA4-5, לחץ היפראוסמוטי גרם לעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של המקבל יחד עם ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות של התורם, מה שמצביע על דחיסה הנגרמת על ידי לחץ היפראוסמוטי של IDR (איור 3A). מגמה זו לא נצפתה ב-ABP (איור 3B). כדי לכמת את ההבדלים ברגישות המבנית בין טיפולי העקה ההיפראוסמוטיים השונים, שרטטנו את יחס ה-FRET (DxAm/DxDm) עבור כל מצב וביצענו בדיקה סטטיסטית חד-כיוונית של ANOVA (איור 4). לבסוף, השווינו את הרגישות המבנית של AtLE4-5 ו- ABP. ראינו ש-AtLEA4-5 הפגין רגישות גבוהה משמעותית מאשר ABP (איור 5).

Figure 1
איור 1: פליטה פלואורסצנטית של טרנספורמנטים מסוג S. cerevisiae . צלחת פטרי SD-ura מצופה ב-S. cerevisiae שעברה טרנספורמציה עם פלסמיד pDRFLIP38-AtLEA4-5. פלואורסצנטיות נצפתה באמצעות טרנסילטור אור כחול ומסנן כתום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תבנית צלחת של 96 בארות עבור מערכת FET. שלושה העתקים טכניים לכל תנאי לחץ היפראוסמוטי ממוקמים בבארות עוקבות. שתי השורות הראשונות (A ו- B) מתאימות לשמונה תנאים עבור מבנה אחד (IDR1). השורות הבאות יכולות להכיל מבנים חדשים (IDR2, IDR3 וכו'). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ספקטרום פליטה פלואורסצנטי מנורמל בתנאי עקה היפראוסמוטיים שונים. ספקטרה אימתה התנהגות FRET טיפוסית בתגובה לטיפול בלחץ היפראוסמוטי (NaCl). (A) AtLEA4-5, IDR רגיש ביותר. העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של המקבל מלווה בירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות של התורם. (B) ABP, חלבון כדורי מעט לא רגיש. פסגות נצפות ב 475 ננומטר ו 525 ננומטר על פי זוג FRET mCerulean3 ו Citrine. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כימות רגישות מבנית בין מצבי עקה היפראוסמוטיים שונים. יחס FRET מנורמל (DxAm/DxDm) של תאי שמרים חיים שטופלו בריכוזים שונים של NaCl. (א) אטלא4-5. (B) חלבון קושר אראבינוז (ABP). n = 9 מדידות בלתי תלויות. ANOVA חד-כיוונית. נ.ס: לא משמעותי. ערכי p: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p< 0.0001. תיבות מייצגות אחוזונים 25-75 (קו בחציון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: השוואת הרגישות המבנית של AtLEA4-5 ו-ABP. (A) יחס FRET מנורמל (DxAm/DxDm) בתנאי לחץ היפראוסמוטיים שונים עבור AtLEA4-5 ו-ABP. n = 3 מדידות בלתי תלויות. (B) ערך Delta FRET (1.5 M - 0 M NaCl) עבור AtLEA4-5 ו- ABP. השינוי מדווח כרגישות המבנית של המבנים שנמדדו במערכת FRET ב- 1.5 M NaCl. n = 3 מדידות עצמאיות. ממוצע ± SD. ANOVA דו-כיווני באמצעות ערכי p הבאים: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p< 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המוצגת כאן מציעה דרך לקבל תובנות כיצד הממדים הגלובליים של אנסמבל ה- IDR חשים ומגיבים להפרעות סביבתיות. שיטה זו מסתמכת על מבנה מקודד גנטית ואינה דורשת רכיבים נוספים מעבר לביטוי יציב של פלסמיד בתאי שמרים, מה שהופך אותה לניתנת להתאמה ליישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים. יתר על כן, הוא רב-תכליתי לחקר הפרעות פיסיקוכימיות אחרות שתאים איקריוטים חווים במהלך מחזור החיים שלהם21. הרזולוציה של FRET ראויה לציון, כאשר העברת האנרגיה מתרחשת רק בסמיכות של פחות מ -10 ננומטר בין התורם למקבל FPs. עם זאת, המגבלה העיקרית היא היעדר מידע מבני מדויק שלא ניתן להשיג בשיטת האנסמבל FET.

ההטרוגניות והגמישות הטבועות ב-IDR מציבות אתגרים בעת לימוד ההרכב שלהם בהקשר תאי, מה שהופך טכניקות כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ללא מעשיות. NMR נחשב לחקר חלבונים לא מסודרים בתאים, אבל תנאים משתנים יכולים להיות בעיה בגלל הפרעות אות22. יישום טכניקת FRET לחקר הרכבים קונפורמטיביים IDR מציע יכולות ייחודיות, המאפשרות מיפוי של התפלגות האוכלוסייה בתוך תאים חיים. בנוסף, ניתן להשלים אותו עם שיטות במבחנה כגון FRET מולקולה בודדת (smFRET), המציגה את יכולת ההסתגלות שלה לגישות שונות ולתנאי ניסוי23. פרוטוקול זה משתמש ב- mCerulean3 כ- FP התורם ובסיטרין כ- FP המקבל, ומספק מערכת פשוטה וקלה למעקב. בחירת זוגות FRET חייבת לשקול בזהירות חפיפה ספקטרלית כדי להפחית את הדיבור הצולב, בין אותות24,25. בעת דיווח על שינויים ברגישות מבנית באמצעות שיטה זו, בחירת מדד FRET מתאים, כגון יעילות FRET (EFRET), היא חיונית לפירוש אותות אמין. לחלופין, ניתן לנתח ולהשוות רגישות מבנית באמצעות יחס FRET (DxAm/DxDm), אך הדבר דורש תיקון זהיר עבור דיבור פלואורסצנטי פלואורסצנטי25 של תורם-מקבל. פענוח נתונים פלואורסצנטיים המתקבלים מקוראי מיקרו-צלחות יכול להיות מושפע מגורמים שונים, כולל תכונות הפלואורופורים, כיוון דיפול, מערכות אינטרמולקולרית-FRET לעומת מערכות FRET תוך-מולקולריות, הכנת דגימות וניתוח נתונים25.

Intermolecular-FRET היא מגבלה עיקרית של שיטת FRET אנסמבל מכיוון שלא ניתן להשליך אותה מהניתוח הראשוני של הנתונים. זה מהווה שיקול חשוב עבור הקורא, כי כמה IDR ידועים לגייס לתוך עיבוי ביומולקולרי26,27. הריכוז המקומי של מקרומולקולות בעיבוי ביומולקולרי הוא גבוה, מה שיכול לגרום לאינטראקציות בין-מולקולריות ובכך להשפיע על קריאת ה-FET. עבור AtLEA4-5, הוכח כי הוא מתכנס בעצמו למבני ניקוב נפרדים על עקה היפראוסמוטית בתאי שמרים6. כדי לשלול את ההשפעה של FRET בין-מולקולרי, החוקרים דגרו על התאים עם 1,6-הקסנדיול (1,6-HD), מולקולה המשבשת עיבוי ביומולקולרי. טיפול 1,6-HD המיס את עיבוי AtLEA4-5, אך רמות ה- FRET לא הופחתו, מה שמצביע על כך שעיבוי חלבונים אינו גורם ל- FRET בין-מולקולרי בלתי רצוי. מכיוון שהשפעה זו תהיה תלויה בכל IDR, על הקוראים לבצע גישות נוספות כגון הלבנה של מקבל או ביטוי משותף של מבנים לתורם בלבד ומקבל בלבד6. עם זאת, המידע המתקבל מאנסמבל FRET בתאים חיים הוא בעל חשיבות רבה לאפיון הרגישות המבנית של IDR.

היבט מורכב של הפרוטוקול המוצג כאן הוא שהוא משתמש באורגניזם שמפגין התנהגות מגיבה ללחץ היפראוסמוטי. בנוכחות ריכוזים חיצוניים גבוהים של נתרן כלורי, מים עוזבים את התא, מגדילים את ריכוז החלבון הכולל ויוצרים סביבה צפופה28. IDR רגישים לשינויים של צפיפות מקרומולקולרית 5,6,11,12. באופן ספציפי, AtLEA4-5, החלבון המשמש כמודל בפרוטוקול זה, היה רגיש למשקלים מולקולריים שונים, אך לא לריכוזים גבוהים של מלחים או גליצרול במבחנה6. מאחר שהצטברות גליצרול חשובה לתגובה ולהסתגלות של תאי שמרים לעקה היפראוסמוטית29, חשוב להדגיש כי התורם העיקרי לדחיסת AtLEA4-5 הוא צפיפות מקרומולקולרית במהלך אירועים מוקדמים של חישת אוסמו. כיצד המבנה של AtLEA4-5 משתנה בשלבי ההתאקלמות הבאים, כאשר גליצרול מצטבר, דורש חקירה נוספת.

חקר דינמיקה קונפורמטיבית בחלבונים לא מסודרים מקיף מגוון טכניקות. בהקשר זה, FRET היא שיטה מרכזית. בהתאם לבירורי המחקר הספציפיים ולתכונות הנשקלות, החוקרים יכולים להשתמש בספקטרוסקופיית NMR in vivo כדי לאפיין IDRs30. בנוסף, smFRET הוא כלי רב ערך עבור מחקרי in vivo 23. ספקטרוסקופיית תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR) היא טכניקה נוספת המשמשת לחקר כמותי של IDR בהקשר תאי31. שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסות הן גם גישות חזקות, שכן הן יכולות לספק מידע מבני של הקונפורמציה התאית של חלבונים32. שיטות אלה כוללות ספקטרומטריית מסה טבעית (native-MS) וספקטרומטריית מסה ניידות יונים (IM-MS)32,33. כל השיטות הללו מאפשרות לחוקרים להתעמק בקונפורמציות המרובות של IDR ובדינמיקה שלו, ולשפוך אור על תרומתן לביולוגיה של התא. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר בעבודה זו לביצוע סינון ראשוני של רגישות מבנית באופן בתפוקה גבוהה. מחקרי המשך יכולים להתמקד בבדיקת הרגישות המבנית בסוג התא הרצוי או עם פוטנציאל להשיג תובנה מכניסטית באמצעות שיטות חוץ גופיות כגון smFRET, CD או SAXS. שילוב השיטות הכרחי לקבלת תמונה ברורה של הרגישות המבנית של IDR בסביבות המשתנות של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת Cuevas-Velazquez על הסקירה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) פרויקט מספר IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), פרויקט מספר 252952; ו- Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) ו- CAPD (CVU 1269643) מודים ל- CONAHCYT על מלגת M.Sc שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner Bio-One 655096
Agar Sigma-Aldrich 5040
BglII New England BioLabs R0144S
BJ5465 cells American Type Culture Collection 208289
Buffer MES 50 mM Sigma-Aldrich M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM Invitrogen 15506017
EDTA 1 mM Merck 108452
Falcon tubes Corning 352057
LB media Sigma-Aldrich L2897
Lithium acetate 0.1 M Sigma-Aldrich L6883
Low Melt Agarose GOLDBIO A-204-25
Microcentrifuge eppendorf 5452000010
Miniprep kit ZymoPure D4210
NaOH 0.02 M Merck 106462
PEG 3,350 40% Sigma-Aldrich 1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 addgene 178189
Plate reader BMG LABTECH CLARIOstar Plus
SacI New England BioLabs R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15632011
SD-Ura Sigma-Aldrich Y1501
Sodium cloride Sigma-Aldrich S9888
Taq polymesare Promega M5123
Transiluminator Accuris instruments E4000
UV-Visible spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate3
YPD media Sigma-Aldrich Y1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 203
הערכת רגישות מבנית של אזורים לא מסודרים במהותם בתגובה לעקה היפראוסמוטית בתאים חיים באמצעות FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. … More

Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. A., Cuevas-Velazquez, C. L. Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET. J. Vis. Exp. (203), e66275, doi:10.3791/66275 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter