Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uppskattning av strukturell känslighet hos inneboende oordnade regioner som svar på hyperosmotisk stress i levande celler med hjälp av FRET

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66275
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

Intrinsically disordered regions (IDR) är flexibla proteindomäner som modifierar sin konformation som svar på miljöförändringar. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) kan uppskatta proteindimensioner under olika förhållanden. Vi presenterar en FRET-metod för att bedöma IDR-strukturell känslighet i levande Saccharomyces cerevisiae-celler under hyperosmotisk stress.

Abstract

Intrinsically disordered regions (IDR) är proteindomäner som deltar i viktiga cellulära processer. Under stressförhållanden förändras de fysikalisk-kemiska egenskaperna i den cellulära miljön, vilket direkt påverkar den konformationella ensemblen av fördjupade granskningar. Fördjupade granskningar är till sin natur känsliga för miljöstörningar. Att studera hur cellens fysikalisk-kemiska egenskaper reglerar konformationsensemblen av IDR är viktigt för att förstå miljökontrollen av deras funktion. Här beskriver vi en steg-för-steg-metod för att mäta den strukturella känsligheten hos IDR i levande Saccharomyces cerevisiae-celler som svar på hyperosmotiska stressförhållanden. Vi presenterar användningen av ensemblefluorescensresonansenergiöverföring (FRET) för att uppskatta hur de globala dimensionerna av IDR förändras under en progressiv ökning av hyperosmotisk stress som påförs celler med vilken osmolyt som helst. Dessutom tillhandahåller vi ett skript för bearbetning av fluorescensmätningar och jämförelse av strukturell känslighet för olika IDR:er. Genom att följa denna metod kan forskare få värdefulla insikter om de konformationsförändringar som IDR genomgår i den komplexa intracellulära miljön vid byte av miljö.

Introduction

Intrinsically disordered regions (IDR) är kritiska komponenter i cellulära processer1. I kombination med strukturerade domäner är IDR viktiga för proteinfunktioner. Aminosyrasammansättningen i IDR är partisk, representerad främst av laddade, hydrofila och små rester. På grund av den här egenskapen betraktas fördjupade granskningar som domäner med låg komplexitet 2,3. Många fördjupade granskningar har fått uppmärksamhet, främst för att dessa regioner spelar en avgörande roll vid patologiska tillstånd, särskilt neurodegenerativa sjukdomar. Sådana sjukdomar kännetecknas av självorganisering och efterföljande extracellulär eller intracellulär deponering av IDR i nervceller4. Exempel på sådana fördjupade granskningar är amyloid-β (Aβ) vid Alzheimers sjukdom, huntingtin (HTT) vid Huntingtons sjukdom och TAR DNA-bindande protein-43 (TDP-43) och sammansmält vid sarkom (FUS) vid amyotrofisk lateralskleros och frontotemporal demens4. Studien av de strukturella förändringarna av IDR i samband med sjukdom har förbättrats avsevärt med spektroskopiska metoder, inklusive fluorescensresonansenergiöverföring (FRET).

Den hydrofila och utvidgade karaktären hos fördjupade granskningar gör dem extremt känsliga för förändringar i de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos lösningsmiljön5. Den grad med vilken den konformationella ensemblen av fördjupade granskningar modifieras av miljön kallas strukturell känslighet 5,6,7. Olika tekniker kan användas för att studera konformation och dynamik hos IDR, inklusive cirkulär dikroism (CD) och lågvinkelröntgenspridning (SAXS)8,9. Tyvärr kräver CD och SAXS stora mängder renade proteiner, så de är inte lämpliga för studier i celler. Däremot är FRET en teknik som mäter fluorescensintensiteten hos två fluorescerande molekyler som specifikt märker en IDR, vilket innebär att de kan övervakas i komplexa blandningar som levande celler10. Att dynamiskt mäta den strukturella känsligheten hos IDR i levande celler är nödvändigt för att förstå hur miljön reglerar konformationen och funktionen hos det störda proteomet.

FRET är en kraftfull metod för att kvantifiera den strukturella känsligheten hos IDR:er, såväl som globulära och multidomäna proteiner i levande celler. Metoden kräver en konstruktion som består av en IDR av intresse inklämd mellan två fluorescerande proteiner (FP), ett så kallat FRET-par. För detta protokoll föreslår vi användning av mCerulean3 som donator-FP och citrin som acceptor-FP, på grund av deras stora dynamiska omfång, jämfört med andra FP som rapporterats i en tidigare studie om IDR-känslighet6. FRET har tidigare utnyttjats för att mäta den strukturella känsligheten hos en växt-IDR i olika cellulära sammanhang6. Dessutom har denna teknik använts för att karakterisera övergripande proteindimensioner av IDR av olika forskargrupper både in vitro och in vivo 5,11.

Här beskriver vi ensemble FRET-metoden för att studera den strukturella känsligheten hos IDR i levande jästceller (Saccharomyces cerevisiae). Vi visar representativa resultat som är baserade i en anläggnings-IDR som heter AtLEA4-5. AtLEA4-5 är oordnad i lösning, men veckas till α-helix när makromolekylär trängsel induceras in vitro12. AtLEA4-5 är en bra referensmodell för denna metod eftersom den är relativt liten (158 rester), oordnad och känslig för miljöstörningar som rapporterats in silico och in vitro 6,12. Metoden som presenteras här kan skalas för metoder med hög genomströmning eftersom jästceller är lätta att odla och behandlingen appliceras i små volymer. Dessutom kan små modifieringar av protokollet tillämpas på andra cellulära system som bakterier och växtceller6. Protokollet kan utföras i vilket molekylärbiologiskt laboratorium som helst med tillgång till en mikroplattläsare med fluorescensläge, en utrustning som finns på de flesta forskningsinstitutioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmidkonstruktion

  1. Förstärk den öppna läsramen (ORF) som kodar för önskad IDR genom polymeraskedjereaktion (PCR). Ta inte med stoppkodonet eftersom ORF kommer att flankeras av de gener som kodar för de fluorescerande proteinerna. För förstärkningen, designa primers med SacI (5') och BglII (3') restriktionsställen.
    OBS: För avsnittet med representativa resultat använde vi AtLEA4-5 som vald IDR. Vi amplifierade ORF för AtLEA4-5 från pTrc99A-AtLEA4-5 plasmid12.
  2. Smält ORF PCR-produkten genom konsekutiv restriktion med SacI- och BglII-enzymer13.
  3. Skaffa den kommersiella plasmiden pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) från Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
  4. Genomför en konsekutiv restriktion med SacI- och BglII-enzymer för att avlägsna AtLEA4-5 ORF från pDRFLIP38-AtLEA4-5-plasmiden, vilket lämnar en öppen plasmid som innehåller FRET-paret13.
  5. Rena de smälta DNA-fragmenten med hjälp av gelåtervinning från en agarosgelelektrofores14. Ligera de begränsade fragmenten med hjälp av DNA-ligas15.
  6. Omvandla kloningsreaktionen till kompetenta Escherichia coli-celler (DH5α eller besläktade stammar) och selektera i Luria-Bertani (LB) plattor innehållande 50 μg/ml ampicillin16. Odla över natten (ON) vid 37 °C.
  7. Isolera och odla minst fem transformerade samhällen i en ny platta och genotyp med PCR17. Rena plasmid-DNA från en positiv transformerad koloni med hjälp av standardmetoder för miniprep18.
  8. Verifiera extraktionen och integriteten hos plasmid-DNA med agarosgelelektrofores19. Kontrollera korrekt kloning av konstruktionen med hjälp av Sanger-sekvens20.

2. Plasmiduttryck i jästceller

OBS: Använd aseptiska standardtekniker för att utföra följande steg. Använd en kulturhuv med laminärt flöde eller en tändare.

  1. Inokulera en strimma av S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) i 3 ml jästptondextrosmedium (YPD) och odla ON vid 30 °C och 200 rpm.
    OBS: BJ5465 är en proteasbrist (CH1) stam som rekommenderas för arbete med IDR. Andra stammar av S. cerevisiae kan testas och användas.
  2. Centrifugera 1 ml av den mättade jästkulturen (OD600 ~ 3-4) över natten vid 14 000 x g i 1 minut. Ta försiktigt bort supernatanten genom pipettering.
  3. Återsuspendera pelleten i 1 ml Tris-EDTA (TE) buffert (pH 7.5) genom att försiktigt snärta till röret. Centrifugera vid 14 000 x g i 1 minut och ta försiktigt bort supernatanten.
  4. Återsuspendera pelleten i 500 μl Lazy Bones-buffert (40 % w/v PEG 3,350; 100 mM litiumacetat; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,5) genom pipettering. Tillsätt 25 μl kokt (100 °C i 5 min, följt av kylning på is i 5 min) laxspermie-DNA (2 mg/ml) till de återsuspenderade jästcellerna.
  5. Tillsätt 100 ng plasmid-DNA till blandningen och virvla blandningen i 1 minut för att säkerställa noggrann blandning. Låt blandningen stå i rumstemperatur i 1-2 timmar.
  6. Värmechocka jästblandningen vid 42 °C i 12 minuter och kyl sedan på is i ytterligare 12 minuter. Centrifugera röret med 14 000 x g i 1 minut och ta försiktigt bort supernatanten.
  7. Återsuspendera pelleten i 1 ml TE-buffert (pH 7,5). Platta 100 μL av de transformerade cellerna på jäst Syntetiskt bortfall Medium utan uracilplattor (SD-ura) kompletterat med 15 g/L agar.
  8. Inkubera plattorna vid 30 °C i 2–3 dagar (figur 1). Stryk minst fem jästtransformanter i en ny platta och odla PÅ.

3. Validering av jästtransformanter

  1. Välj en liten del av varje transformantkandidat genom att försiktigt skrapa och återsuspendera i 5 μL 20 mM NaOH i enskilda PCR-rör.
  2. Värm provet vid 99 °C i 10 minuter i en termocykel för att lysera cellerna och frigöra DNA i lösningen. Detta steg är avgörande för att förbereda DNA-mallen för PCR.
  3. Överför 1 μl av det kokta provet till en separat PCR-reaktionsblandning som innehåller lämpliga primrar och PCR-reagenser för genotypning. Vi använde följande primers: Forward primer: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. Omvänd primer: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
  4. Ställ in en PCR-reaktion och validera närvaron av rätt plasmid med hjälp av agarosgelelektrofores. Välj en transformant för ytterligare experiment.

4. Beredning av jästcellodling för FRET-analys

  1. Inokulera en strimma av det valda jästtransformantet i 3 ml flytande 1x SD-Ura-medium.
    OBS: Gör denna procedur i en huv med laminärt flöde och sterilt material.
  2. Odla vid 30 °C, 200 rpm i minst 12 timmar för att nå mättnad. Mät OD600. Tillväxten bör ligga mellan OD600 = 1,0-2,0.
    OBS: Om OD600 är lägre än 1,0, ge cellerna mer inkubationstid att växa. Om OD600 överskrider 2.0, fortsätt inte och starta om från steg 4.1.

5. Jästcellberedning för FRET-analys

  1. Samla upp 2 ml av jästkulturen över natten och centrifugera vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten genom pipettering.
  2. Återsuspendera pelleten i 1 ml 50 mM 2-(N-Morpholino) etansulfonsyra (MES) buffert (pH 6).
  3. Centrifugera vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten.
  4. Upprepa steg 5.2 och 5.3. Återsuspendera jästcellerna i 2 ml MES-buffert, pH 6 och häll volymen i en reagensbehållare.

6. Ställa in fluorescensmätningarna

OBS: Den aktuella skanningen anses vara utförd i en mikroplattläsare med fluorescensläge.

  1. För grundinställningar, ställ in instrumentet enligt följande: Mättyp: Fluorescensintensitet (FI) spektrum; Mikroplattans namn: Greiner 96 F-botten.
  2. För optiska inställningar, ställ in instrumentet enligt följande: Nej. Antal avsökningspunkter för våglängder: 91; Excitationsvåglängd: 433 nm; Excitation bandbredd: 10 nm; Emissionsvåglängd: 460 - 550; Stegbredd: 1 nm; Bandbredd för utsläpp: 10 nm; Brännvidd erhållen med autofokus; Brännvidd: 5 mm; Våglängd som används för förstärkning: 490 nm.
  3. För allmänna inställningar, ställ in instrumentet enligt följande: Inställningstid: 0.1 s; Läsriktning: enkelriktad, horisontell från vänster till höger, uppifrån och ned.
    OBS: Den manuellt inmatade förstärkningen måste justeras för varje mätning med hjälp av den brunn som förväntas visa de högsta fluorescensintensitetsnivåerna under hela våglängdsskanningen.

7. Beredning av hypertoniska lösningar och fluorescensmätningar

  1. Bered lösningar på 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1 M, 1.5 M och 2 M NaCl i en 96-håls svart platta med klar botten. Den slutliga volymen i varje brunn kommer att vara 200 μL (150 μL osmolytlösning + 50 μL jästcellsuspension).
    OBS: Andra osmolyter kan användas för att inducera hyperosmotisk stress. Alla lösningar måste beredas i 50 mM MES-buffert pH 6.
  2. Fyll på 150 μl 50 mM MES-buffert, pH 6 i de tre första brunnarna i rad A (A1, A2, A3) och tillsätt 150 μl av motsvarande lösning i stigande ordning från vänster till höger (figur 2). För att testa alla föreslagna koncentrationer, fortsätt belastningen på rad B.
    OBS: Denna inställning tar hänsyn till mätningarna av 3 tekniska replikat för varje koncentration.
  3. Använd en 12-kanals mikropipett för att överföra 50 μL tvättade jästceller till varje brunn. Jästceller tenderar att sedimentera till botten av reservoaren. Se till att återsuspendera jästsuspensionen noggrant genom att pipettera upp och ner innan du överför cellerna.
  4. Ladda cellerna i 96-hålsplattan som innehåller de olika lösningarna och blanda väl genom att pipettera upp och ner minst 4 gånger.
  5. Mät omedelbart emissionsspektra för fluorescensintensitet för de önskade brunnarna i en mikroplattläsare med specifikationsinställningarna i steg 6. Upprepa proceduren för varje IDR som ska testas i FRET-analysen.
  6. Valfritt steg. Om det är tillgängligt mäter du en konstruktion med endast donator (pDRFLIP38-mCerulean3) genom att följa stegen som beskrivs här.
    OBS: Vi rekommenderar att du utför detta steg för att beräkna varje villkors FRET-effektivitet. Om läsaren inte kan utföra detta steg kan FRET beräknas med hjälp av FRET-förhållandemetoden. Båda metoderna för FRET-beräkningar förklaras i steg 8 och 9.
  7. Utför minst tre repliker på tre oberoende dagar för varje konstruktion.

8. Databehandling med hjälp av FRET-effektivitetsmetoden

OBS: För läsare med kunskap om programmeringsspråket R tillhandahåller vi en uppsättning R-skript för att utföra databehandling som beskrivs i det här avsnittet. Skript finns på https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Följ instruktionerna i README-filen.

  1. Exportera data som .xlsx filer från mikroplattläsaren.
  2. Normalisera fluorescensintensitetsvärdena vid varje skanningsvåglängd till den isobestiska punkten för det använda FRET-paret.
    OBS: Detta steg är nödvändigt för att jämföra spektra för alla testade förhållanden. Den isobestiska punkten för mCerulean3 och Citrin FRET-paret är 515 nm. Erhåll till exempel förhållandet mellan fluorescensintensitetsvärdena 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm och så vidare.
  3. Beräkna medelvärdet för varje tekniskt replikat när fluorescensvärdena har normaliserats. Totalt bör det finnas en kolumn för varje tillstånd av hyperosmotisk stress.
  4. Visualisera alla fluorescensintensitetsspektra i samma diagram (figur 3). Varje spektrum bör uppvisa en kombination av fluorescensemissionsspektra för enskilda mCerulean3 och citrin. I sällsynta fall, där FRET-effektiviteten är 0, kommer endast donatorns fluorescensemissionsspektrum att observeras, eller när FRET-effektiviteten är 1, kommer endast acceptorfluorescensen att observeras. Fluorescensemissionstoppen för mCerulean3 (donator) är 475 nm och fluorescensemissionstoppen för citrin (acceptor) är 525 nm.
  5. Bestäm om fluorescensmätningen visar en typisk FRET-förändring som svar på hyperosmotisk stress. Om konformationen av IDR är känslig för behandlingen, kommer detta att återspeglas som en förändring i FRET-effektiviteten. En typisk förändring i FRET-effektiviteten kommer att koppla en minskning av fluorescensintensiteten hos donatorn med en ökning av fluorescensintensiteten hos acceptorn eller vice versa.
  6. Kvantifiera FRET-effektiviteten (EFRET). Erhåll donatorns (mCerulean3) normaliserade toppvärden (475 nm/515 nm) för IDR-konstruktionen och donatorns konstruktion för varje tillstånd av hyperosmotisk stress. Använd de normaliserade medelvärdena för de tekniska replikaten. Utför den här åtgärden för vart och ett av de tre oberoende replikaten. Beräkna EFRET med följande formel:
    Equation 1
    Där IDA är förhållandet 475 nm/515 nm från IDR-konstruktionen (FRET-parkonstruktionen), och ID är förhållandet 475 nm/515 nm från konstruktionen med enbart givare.
  7. Jämför FRET-effektiviteten. Normalisera EFRET-värdena för varje hyperosmotiskt stresstillstånd till EFRET för icke-spänningstillståndet (t.ex.ample, 0 M NaCl). Gör jämförelser med hjälp av ett lådagram eller ett jämnt kurvdiagram. Utför en envägs ANOVA följt av ett statistiskt test av Tukey efter hoc (p-värden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

9. Databehandling med hjälp av FRET-kvotmetoden

OBS: Om mätningar endast av donatorer inte kan erhållas, utför FRET-förhållandemetoden. Denna metod jämför FRET-förhållandet över de olika hyperosmotiska stressförhållandena. Steg 7.1 till 7.5 bör utföras före stegen i det här avsnittet för att validera ett typiskt FRET-beteende. För läsare med kunskap om programmeringsspråket R tillhandahåller vi en uppsättning R-skript för att utföra databehandling som beskrivs i det här avsnittet. Skript finns på https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Följ instruktionerna i README-filen.

  1. Extrahera data vid 475 nm och 525 nm från xlsx file tidigare exporterad från mikroplattläsaren. Dessa värden motsvarar fluorescensemissionstoppen för mCerulean3 (donator, DxDm) och fluorescensemissionstoppen för citrin (acceptor, DxAm) när donatorfluoroforen exciteras (433 nm).
  2. Normalisera fluorescensintensitetsvärdena vid 475 nm och 525 nm till den isobestiska punkten för det använda FRET-paret. Den isobestiska punkten för mCerulean3 och Citrin FRET-paret är 515 nm. Erhåll FRET-förhållandet (DxAm/DxDm).
  3. Jämför FRET-förhållanden. Normalisera DxAm/DxDm-värdena för varje hyperosmotiskt stresstillstånd till medelvärdet för DxAm/DxDm för icke-stresstillståndet (t.ex.ample, 0 M NaCl). Gör jämförelser med hjälp av ett lådagram eller ett jämnt kurvdiagram (figur 4 och figur 5). Utför en envägs ANOVA följt av ett statistiskt test efter hoc Tukey (p-värden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter att ha transformerat jästceller med pDRFLIP38-AtLEA4-5-plasmid observerades fluorescensen hos de positiva transformanterna med en transilluminator med blått ljus och ett filter (Figur 1). Att förbereda de olika lösningarna för att inducera hyperosmotisk stress är tidskrävande, så vi föreslår att du följer mallen för 96 brunnar i figur 2. Omedelbart efter den hyperosmotiska stressbehandlingen med varierande koncentrationer av natriumklorid erhölls fluorescensemissionsspektra (Figur 3). Fluorescensemissionsspektra för varje tillstånd erhölls för att validera ett typiskt FRET-förändringsbeteende. Normalisering av fluorescensintensitetsvärdena till den isobestiska punkten krävs för att korrigera experimentella fel. För dessa representativa resultat testade vi den tidigare rapporterade AtLEA4-5, som är en mycket känslig anläggning IDR6. Som referens testade vi också det något okänsliga ABP globulära proteinet (Figur 3). Det kan observeras att båda konstruktionerna uppvisar en kombination av mCerulean3 och citrinemissionsspektra (toppar för donator- och acceptor-FPs), vilket indikerar en viss grad av basal FRET-effektivitet under standardförhållanden (0 M NaCl). För AtLEA4-5 orsakade hyperosmotisk stress en ökning av acceptorns fluorescensintensitet i kombination med en minskning av givarens fluorescensintensitet, vilket tyder på hyperosmotisk stressinducerad komprimering av IDR (Figur 3A). Denna trend observerades inte i ABP (figur 3B). För att kvantifiera skillnader i strukturell känslighet mellan de olika hyperosmotiska stressbehandlingarna plottade vi FRET-förhållandet (DxAm/DxDm) för varje tillstånd och utförde ett envägs ANOVA-statistiskt test (figur 4). Slutligen jämförde vi den strukturella känsligheten hos AtLE4-5 och ABP. Vi observerade att AtLEA4-5 uppvisade en signifikant högre känslighet än ABP (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Fluorescensemission av S. cerevisiae-transformanter . SD-ura petriskål pläterad med S. cerevisiae transformerad med plasmiden pDRFLIP38-AtLEA4-5. Fluorescens observerades med hjälp av en transilluminator med blått ljus och ett orange filter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: En mall för 96-brunnars platta för FRET-systemet. Tre tekniska replikat för varje hyperosmotiskt spänningstillstånd placeras i på varandra följande brunnar. De två första raderna (A och B) passar åtta villkor för en konstruktion (IDR1). Följande rader kan hantera nya konstruktioner (IDR2, IDR3 osv.). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Normaliserade fluorescensemissionsspektra under olika hyperosmotiska spänningsförhållanden. Spectra validerade ett typiskt FRET-beteende som svar på behandling av hyperosmotisk stress (NaCl). (A) AtLEA4-5, en mycket känslig fördjupad granskning. Ökningen av acceptorns fluorescensintensitet är kopplad till minskningen av givarens fluorescensintensitet. (B) ABP, ett något okänsligt globulärt protein. Toppar observeras vid 475 nm och 525 nm enligt FRET-paret mCerulean3 och Citrine. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Kvantifiering av strukturell känslighet över olika hyperosmotiska stressförhållanden. Normaliserat FRET-förhållande (DxAm/DxDm) av levande jästceller behandlade med olika koncentrationer av NaCl. (A) AtLEA4-5. B) Arabinosbindande protein (ABP). n = 9 oberoende mätningar. Envägs ANOVA. NS: Icke-signifikant. p-värden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Rutorna representerar den 25:e–75:e percentilen (linje vid medianen). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Jämförelse av den strukturella känsligheten hos AtLEA4-5 och ABP. (A) Normaliserat FRET-förhållande (DxAm/DxDm) under olika hyperosmotiska stressförhållanden för AtLEA4-5 och ABP. n = 3 oberoende mätningar. (B) Delta FRET-värde (1,5 M - 0 M NaCl) för AtLEA4-5 och ABP. Förändring rapporteras som den strukturella känsligheten hos konstruktionerna mätt i FRET-systemet vid 1,5 M NaCl. n = 3 oberoende mätningar. ±Tvåvägs ANOVA med följande p-värden: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som presenteras här erbjuder ett sätt att få insikter i hur de globala dimensionerna av ensemblen av fördjupade granskningar uppfattar och reagerar på miljöstörningar. Denna metod bygger på en genetiskt kodad konstruktion och kräver inga ytterligare komponenter utöver ett plasmidstabilt uttryck i jästceller, vilket gör den anpassningsbar för potentiella tillämpningar i andra celltyper. Dessutom är den mångsidig för att utforska andra fysikalisk-kemiska störningar som eukaryota celler upplever under sin livscykel21. Upplösningen av FRET är anmärkningsvärd, med energiöverföring som endast sker inom en närhet av mindre än 10 nm mellan givar- och acceptor-FP. Den största begränsningen är dock frånvaron av exakt strukturell information som inte kan erhållas med ensemble FRET-metoden.

Den inneboende heterogeniteten och flexibiliteten hos IDR utgör utmaningar när man studerar deras ensemble i ett cellulärt sammanhang, vilket gör tekniker som röntgenkristallografi opraktiska. NMR har övervägts för att studera oordnade proteiner i celler, men förändrade förhållanden kan vara ett problem på grund av signalinterferens22. Att implementera FRET-tekniken för att studera IDR-konformationsensembler erbjuder unika möjligheter, vilket möjliggör kartläggning av populationsfördelningen i levande celler. Dessutom kan den kompletteras med in vitro-metoder såsom enmolekylär FRET (smFRET), vilket visar dess anpassningsförmåga till olika tillvägagångssätt och experimentella förhållanden23. Detta protokoll använder mCerulean3 som donator-FP och Citrin som acceptor-FP, vilket ger ett enkelt och lättspårat system. Val av FRET-par måste noggrant överväga spektral överlappning för att mildra överhörningen mellan signalerna24,25. När du rapporterar förändringar i strukturell känslighet med denna metod är det avgörande att välja ett lämpligt FRET-mått, såsomFRET-effektivitet (E FRET), för tillförlitlig signaltolkning. Alternativt kan strukturell känslighet analyseras och jämföras med hjälp av FRET-förhållandet (DxAm/DxDm), men detta kräver en noggrann korrigering för fluorescensöverhörning25. Tolkning av fluorescensdata som erhållits från mikroplattläsare kan påverkas av olika faktorer, inklusive fluoroforernas egenskaper, dipolorientering, intermolekylära-FRET kontra intramolekylära-FRET-system, provberedning och dataanalys25.

Intermolekylär FRET är en stor begränsning av ensemble FRET-metoden eftersom det inte är möjligt att bortse från den initiala analysen av data. Detta innebär en viktig faktor för läsaren, eftersom vissa fördjupade granskningar är kända för att rekrytera till biomolekylära kondensat26,27. Den lokala koncentrationen av makromolekyler i biomolekylära kondensat är hög, vilket kan inducera intermolekylära interaktioner och därmed påverka FRET-avläsningen. För AtLEA4-5 visades det att det självorganiserar sig till diskreta punktionsstrukturer vid hyperosmotisk stress i jästceller6. För att utesluta effekten av intermolekylär FRET inkuberade författarna cellerna med 1,6-hexandiol (1,6-HD), en molekyl som stör biomolekylära kondensat. 1,6-HD-behandling löste upp AtLEA4-5-kondensaten, men FRET-nivåerna minskade inte, vilket tyder på att proteinkondensation inte orsakar oönskad intermolekylär FRET. Eftersom denna effekt kommer att bero på varje IDR, bör läsarna utföra ytterligare metoder som t.ex. fotoblekning av acceptor eller samuttryck av konstruktioner med endast givare och endast mottagare6. Ändå är den information som erhålls från ensemble FRET i levande celler av betydelsefull relevans för att karakterisera den strukturella känsligheten hos IDR.

En invecklad aspekt av protokollet som presenteras här är att det använder en organism som uppvisar ett lyhört beteende mot hyperosmotisk stress. I närvaro av höga externa koncentrationer av natriumklorid lämnar vatten cellen, vilket ökar den totala proteinkoncentrationen och skapar en trång miljö28. Fördjupade granskningar är känsliga för förändringar i makromolekylär trängsel 5,6,11,12. Specifikt var AtLEA4-5, proteinet som används som modell i detta protokoll, känsligt för olika molekylviktsträngare, men inte för höga koncentrationer av salter eller glycerol in vitro6. Eftersom ackumuleringen av glycerol är viktig för jästcellernas respons och acklimatisering till hyperosmotisk stress29, är det relevant att betona att den huvudsakliga bidragsgivaren till AtLEA4-5-komprimering är makromolekylär trängsel under tidiga händelser av osmo-avkänning. Hur strukturen av AtLEA4-5 förändras under efterföljande stadier av acklimatisering, när glycerol ackumuleras, kräver ytterligare undersökning.

Att utforska konformationsdynamik i oordnade proteiner omfattar en mängd olika tekniker. I detta sammanhang är FRET en central metod. Beroende på de specifika forskningsundersökningarna och funktionerna som övervägs kan utredare använda in vivo NMR-spektroskopi för att karakterisera IDR30. Dessutom är smFRET ett värdefullt verktyg för in vivo-studier 23. Elektronparamagnetisk resonansspektroskopi (EPR) är en annan teknik som används för att kvantitativt studera IDR i ett cellulärt sammanhang31. Masspektrometribaserade metoder är också kraftfulla metoder, eftersom de kan ge strukturell information om proteiners cellulära konformation32. Dessa metoder inkluderar nativt masspektrometri (nat-MS) och jonmobilitetsmasspektrometri (IM-MS)32,33. Alla dessa metoder gör det möjligt för forskare att fördjupa sig i de många konformationerna av en IDR och dess dynamik, vilket belyser deras bidrag till cellbiologin. Protokollet som beskrivs i detta arbete kan användas för att utföra en initial screening av strukturell känslighet på ett sätt med hög genomströmning. Uppföljande studier kan fokusera på att testa den strukturella känsligheten i en önskad celltyp eller med potential att få mekanistisk insikt genom in vitro-metoder som smFRET, CD eller SAXS. Kombinationen av metoder är nödvändig för att få en tydlig bild av den strukturella känsligheten hos IDR i cellernas föränderliga miljöer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i Cuevas-Velázquez laboratorium för den kritiska granskningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) projektnummer IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), projektnummer 252952. och Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) och CAPD (CVU 1269643) erkänner CONAHCYT för deras M.Sc. Stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner Bio-One 655096
Agar Sigma-Aldrich 5040
BglII New England BioLabs R0144S
BJ5465 cells American Type Culture Collection 208289
Buffer MES 50 mM Sigma-Aldrich M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM Invitrogen 15506017
EDTA 1 mM Merck 108452
Falcon tubes Corning 352057
LB media Sigma-Aldrich L2897
Lithium acetate 0.1 M Sigma-Aldrich L6883
Low Melt Agarose GOLDBIO A-204-25
Microcentrifuge eppendorf 5452000010
Miniprep kit ZymoPure D4210
NaOH 0.02 M Merck 106462
PEG 3,350 40% Sigma-Aldrich 1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 addgene 178189
Plate reader BMG LABTECH CLARIOstar Plus
SacI New England BioLabs R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15632011
SD-Ura Sigma-Aldrich Y1501
Sodium cloride Sigma-Aldrich S9888
Taq polymesare Promega M5123
Transiluminator Accuris instruments E4000
UV-Visible spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate3
YPD media Sigma-Aldrich Y1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 203
Uppskattning av strukturell känslighet hos inneboende oordnade regioner som svar på hyperosmotisk stress i levande celler med hjälp av FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. … More

Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. A., Cuevas-Velazquez, C. L. Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET. J. Vis. Exp. (203), e66275, doi:10.3791/66275 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter