التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula
Summary
هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. آراء الثقافات الحية تظهر الخلايا 1 بعد ساعة من الطلاء ، والخلايا العصبية متباينة بعد 2 أيام من النمو في وسط بيكربونات المستندة إلى المعرفة. والخلايا العصبية كهربائيا منفعل وشكل اتصالات متشابك.
Abstract
هذا الفيديو يوضح الإجراء لصنع الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. وأظهرت وسائل لجمع الأجنة وdechorionation وذلك باستخدام مواد التبييض. باستخدام الماصة الزجاج تعلق على الفم أنبوب الشفط ، نحن لتوضيح وإزالة جميع الخلايا من الأجنة واحد. ويتضح من طريقة لتفريق الخلايا من كل embyro إلى انخفاض عدد (5 لتر) متوسطة صغيرة من الزجاج على ساترة غير المصقول. وجهة نظر من خلال المجهر في 1 ساعة بعد الطلاء يوضح كثافة الخلية المفضل. معظم الخلايا التي تزرع في البقاء على قيد الحياة عندما يتم تعريف المتوسطة neuroblasts التي تقسم مرة أو أكثر في الثقافة قبل توسيع العمليات لالتهاب الأعصاب من قبل 12-24 ساعة. وجهة نظر من خلال المجهر يوضح مستوى ثمرة neurite والمتفرعة من المتوقع في ظل ثقافة صحية في 2 أيام في المختبر. تزرع الثقافات في بيكربونات البسيط القائم المتوسطة محددة ، في حاضنة CO 2 5 ٪ إلى 22-24 درجة مئوية. عمليات التهاب الأعصاب مواصلة تطويرها على مدى الأسبوع الأول في الثقافة وعندما اجراء اتصالات مع neurites من الخلايا المجاورة التي غالبا ما تشكل اتصالات متشابك وظيفية. الخلايا العصبية في التعبير عن هذه الثقافات الجهد بوابات الصوديوم والكالسيوم والبوتاسيوم ، وقنوات ومنفعل كهربائيا. ثقافة هذا النظام مفيد لدراسة العوامل الوراثية الجزيئية والبيئية التي تنظم تمايز الخلايا العصبية ، استثارة ، وتشكيل المشبك / وظيفة.
Protocol
Discussion
في الثقافات ذبابة الفاكهة المحضرة من الأجنة مرحلة midgastrula الخلايا العصبية تنشأ من neuroblast السلائف ، وكثير منها الفجوة قبل التمايز في المختبر. هذا النظام يوفر بالتالي فرصة فريدة لاستكشاف عوامل وراثية وبيئية مهمة في مراحل مبكرة جدا من تطور الخلايا العصبية (Rohrbaugh وآخرون ، 2003). لقد أظه?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS27501 DKOD. مزيد من الدعم لهذا العمل من المنح أستاذ HHMI إلى DKOD.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
| Transferrin | Reagent | Sigma | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
| Insulin | Sigma | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
| Selenium | Sigma | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| Progesterone | Sigma | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
| Petri dishes | ||||
| Cover-slips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
| Paper filter | Whatman | #1 | ||
| 10cc syringe | Tool |
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.
Referências
- Rohrbough, J., O’Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O’Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O’Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O’Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O’Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
