Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Summary

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Pontos de vista de culturas vivas mostram as células de 1 hora após o plaqueamento e neurônios diferenciados após 2 dias de crescimento em um meio de bicarbonato baseado definido. Os neurônios são eletricamente excitáveis ​​e formam conexões sinápticas.

Abstract

Este vídeo ilustra o procedimento para a tomada de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Os métodos de coleta de embriões e sua dechorionation o uso de alvejante são demonstradas. Usando uma pipeta de vidro ligado a um tubo de sucção da boca, que ilustram a remoção de todas as células de embriões individuais. O método para dispersar as células de cada embrionários em uma queda (5 l) pequenas de meio sobre uma lamela de vidro sem revestimento é demonstrada. Uma visão através do microscópio, 1 hora após o plaqueamento ilustra a densidade celular preferido. A maioria das células que sobrevivem quando cultivada em meio definido são neuroblastos que dividem uma ou mais vezes na cultura antes de estender processos neuríticas por 12-24 horas. Uma visão através do microscópio ilustra o nível de crescimento de neuritos e ramificação esperado em uma cultura saudável de dois dias in vitro. As culturas são cultivadas em um bicarbonato simples, baseada médio definido, em um 5% CO ₂ incubadora a 22-24 ° C. Processos neuríticas continuar a desenvolver durante a primeira semana de cultura e quando fazem contato com neurites de células vizinhas que muitas vezes forma funcional conexões sinápticas. Neurônios nessas culturas, se manifesta de sódio voltagem dependentes, cálcio e canais de potássio e são eletricamente excitáveis. Este sistema de cultura é útil para estudar molecular fatores genéticos e ambientais que regulam a diferenciação neuronal, excitabilidade, e formação de sinapses / função.

Protocol

I. de colheita de embriões Drosophila Prepare pratos de coleta de ovos Ferva 200 ml dH 2 O com 8 g de agar Arrefecer a 50 ° C Adicionar 2 ml EtOH e 2 ml de ácido acético Despeje em 35 milímetros petri pratos de plástico, tops Esfriar e guarde em recipiente apertado do ar a 4 ° C Faz cerca de 80 placas Prepare colar Yeast Dissolver o fermento Fleishmans ativa fermento em água para formar colar Mi…

Discussion

Em culturas de Drosophila preparados a partir de embriões em estágio midgastrula os neurônios surgem a partir de precursores neuroblastos, muitos dos quais divide antes de diferenciação in vitro. Este sistema, portanto, proporciona uma oportunidade única para a exploração de fatores genéticos e ambientais importantes em fases muito iniciais de desenvolvimento neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nós temos mostrado que os neurônios cultivados em um meio simples definida diferenciar em neurônios eletricamente excitáveis ​​que t…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.