Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

Summary

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Puntos de vista de las culturas show en vivo de las células de una hora después de la siembra y las neuronas diferenciadas después de 2 días de crecimiento en un medio de bicarbonato definido. Las neuronas son eléctricamente excitables y forman conexiones sinápticas.

Abstract

Este video muestra el procedimiento para la toma de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Los métodos de recogida de embriones y su dechorionation el uso de cloro se ha demostrado. Con una pipeta de vidrio conectado a un tubo de succión de la boca, que ilustran la eliminación de todas las células de los embriones individuales. El método para la dispersión de las células de cada embyro en una pequeña (5 litros) gota de medio en un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento se demuestra. Una vista a través del microscopio menos 1 hora después de la siembra ilustra la densidad celular preferida. La mayoría de las células que sobreviven cuando se cultivan en un medio definido son los neuroblastos que dividen a una o más veces en la cultura antes de extender los procesos de neuríticas por 12-24 horas. Una vista a través del microscopio muestra el nivel de crecimiento de las neuritas y la ramificación se espera en una cultura sana en 2 días in vitro. Los cultivos se envían en un bicarbonato de simple basada medio definido, en un 5% de CO ₂ incubadora a 22-24 ° C. Procesos neuríticas siga elaborando durante la primera semana de la cultura y cuando hacen contacto con neuritas de las células vecinas a menudo se forman conexiones sinápticas funcionales. Las neuronas en estas culturas, se manifiestan de voltaje de sodio, calcio, y los canales de potasio y son eléctricamente excitables. Este sistema de cultivo es útil para el estudio molecular de factores genéticos y ambientales que regulan la diferenciación neuronal, la excitabilidad, y la formación de sinapsis / función.

Protocol

I. Drosophila de recogida de embriones Preparar las placas de recolección de huevos Hervir 200 ml dH 2 O con 8 g de agar Enfriar a 50 ° C Añadir 2 ml de EtOH y 2 ml de ácido acético Vierta la mezcla en 35 mm placas petri de plástico, tapas Dejar enfriar y guardar en un recipiente hermético a 4 º C Hace aproximadamente 80 placas Preparar pasta de levadura Disolver la levadura para hornear Fleishmans activo…

Discussion

En cultivos de Drosophila preparado a partir de embriones etapa midgastrula las neuronas surgen a partir de precursores neuroblastos, muchos de los cuales se dividen antes de la diferenciación in vitro. Así, este sistema ofrece una oportunidad única para la exploración de los factores genéticos y ambientales importantes en las fases muy tempranas del desarrollo neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Hemos demostrado que las neuronas cultivadas en un medio simple definido diferenciarse en neuronas eléctricamente excitables, que también fo…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.