Préparation des cultures de neurones d'embryons de drosophile Midgastrula scène

Summary

Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones d'embryons de drosophile midgastrula scène. Vues des cultures vivantes montrent les cellules 1 heure après le placage et les neurones différenciés après 2 jours de croissance dans un milieu à base de bicarbonate défini. Les neurones sont électriquement excitables et forment des connexions synaptiques.

Abstract

Cette vidéo illustre la procédure de mise cultures neuronales primaires d'embryons de drosophile midgastrula scène. Les méthodes de collecte des embryons et leur dechorionation utilisant l'eau de Javel sont démontrés. Aide d'une pipette en verre attaché à un tube d'aspiration bouche, nous illustrons l'élimination de toutes les cellules issues d'embryons unique. La méthode pour disperser les cellules d'embryons de chaque dans un petit (5 l) goutte de milieu sur une lamelle de verre sans revêtement est démontrée. Une vue à travers le microscope à 1 heure après le placage illustre la densité de cellule préférée. La plupart des cellules qui survivent lorsqu'elles sont cultivées en milieu défini sont neuroblastes qui divisent une ou plusieurs fois dans la culture avant d'étendre les processus neuritique par 12-24 heures. Une vue à travers le microscope illustre le niveau de la croissance des neurites et la ramification attendus dans une culture saine à 2 jours in vitro. Les cultures sont cultivées dans un milieu à base de bicarbonate de simples définis, dans un 5% de CO ₂ incubateur à 22-24 ° C. Processus neuritiques continuer à élaborer au cours de la première semaine de la culture et quand ils entrent en contact avec des neurites des cellules voisines, ils forment souvent des connexions synaptiques fonctionnelles. Les neurones de ces cultures d'exprimer voltage-dépendants sodium, le calcium, et les canaux potassiques et sont électriquement excitables. Ce système de culture est utile pour étudier moléculaires des facteurs génétiques et environnementaux qui régulent la différenciation neuronale, excitabilité et la formation des synapses / fonction.

Protocol

Collection I. embryon de drosophile Préparer les plaques collecte des œufs Faire bouillir 200 ml dH 2 O avec 8 g d'agar Laisser refroidir à 50 ° C Ajouter 2 ml de EtOH et 2 ml d'acide acétique Verser dans des boîtes de 35 mm de Petri en plastique, dessus Refroidir et conserver dans contenant hermétique à 4 ° C Donne environ 80 plaques Préparer la pâte de levure Dissoudre la levure active Fleish…

Discussion

Dans les cultures préparées à partir de la drosophile embryons au stade midgastrula les neurones proviennent de précurseurs neuroblastes, dont beaucoup divisent avant de différenciation in vitro. Ce système offre donc une occasion unique d'étudier les facteurs génétiques et environnementaux importants dans des phases très précoces du développement neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nous avons montré que les neurones cultivés dans un milieu simple défini différencier en neurones électriquement excitables qui a également…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.