De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo's

Summary

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

Abstract

Deze video illustreert de procedure voor het maken van de primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. De methoden voor het verzamelen van embryo's en hun dechorionation met behulp van bleekwater worden gedemonstreerd. Met behulp van een glazen pipet aan een mond zuigbuis, illustreren we de verwijdering van alle cellen van een embryo's. De methode voor het dispergeren van cellen uit elk embyro in een kleine (5 l) druppel medium op een ongecoat glas dekglaasje is aangetoond. Een blik door de microscoop op 1 uur na plating illustreert de voorkeur celdichtheid. Het merendeel van de cellen die overleven wanneer ze groeien in beschreven medium zijn neuroblasts dat een of meer keer in de cultuur te verdelen voor de uitbreiding neuritische processen 12-24 uur. Een blik door de microscoop illustreert het niveau van de neurietuitgroei en vertakking naar verwachting in een gezonde cultuur in 2 dagen in vitro. De cultures worden gekweekt in een eenvoudige bicarbonaat op basis van beschreven medium, in een 5% CO ₂ incubator bij 22-24 ° C. Neuritische processen verder uit te werken over de eerste week in de cultuur en wanneer ze contact maken met de neurieten van naburige cellen die ze vormen vaak functionele synaptische verbindingen. Neuronen in deze culturen te uiten voltage-gated natrium, calcium en kalium kanalen en worden elektrisch opgewonden. Deze cultuur systeem is nuttig voor het bestuderen van moleculaire genetische en omgevingsfactoren die neuronale differentiatie, prikkelbaarheid, en synapsvorming / functie te reguleren.

Protocol

I. Drosophila embryo Bereid ei collectie platen Kook 200 ml dH 2 O met 8 g agar Afkoelen tot 50 ° C Voeg 2 ml EtOH en 2 ml azijnzuur Giet het mengsel in 35 mm plastic petrischaaltjes, tops Cool en op te slaan in luchtdichte container bij 4 ° C Maakt ongeveer 80 platen Bereid Gist plakken Los Fleishmans bakkersgist in water om vorm te plakken Magnetron gedurende 20-30 seconden om gist te doden (pas op …

Discussion

In Drosophila culturen bereid uit midgastrula stadium embryo's van de neuronen ontstaan ​​uit neuroblast voorlopers, waarvan vele delen voorafgaand aan de differentiatie in vitro. Dit systeem biedt dus een unieke gelegenheid voor de exploratie van genetische en omgevingsfactoren belangrijk in een zeer vroege fase van neuronale ontwikkeling (Rohrbaugh et al.., 2003). We hebben aangetoond dat neuronen gekweekt in een eenvoudige beschreven medium differentiëren in elektrisch prikkelbare neuronen die vormen ook functionele synaptische …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.