Midgastrula स्टेज ड्रोसोफिला भ्रूण से Neuronal संस्कृति की तैयारी
Summary
इस वीडियो midgastrula चरण ड्रोसोफिला के भ्रूण से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों की तैयारी को दर्शाता है. जीना संस्कृतियों के दृश्य और एक बिकारबोनिट आधारित परिभाषित मध्यम में विकास के 2 दिनों के बाद चढ़ाना विभेदित न्यूरॉन्स के बाद कोशिकाओं 1 घंटे दिखाते हैं. न्यूरॉन्स विद्युत उत्तेजनीय हैं और synaptic कनेक्शन के रूप में.
Abstract
इस वीडियो midgastrula चरण ड्रोसोफिला भ्रूण से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों बनाने के लिए प्रक्रिया दिखाता है. भ्रूण और उनके dechorionation ब्लीच का उपयोग कर इकट्ठा करने के लिए तरीकों का प्रदर्शन कर रहे हैं. एक गिलास एक मुँह चूषण ट्यूब से जुड़ी pipet का उपयोग करना, हम एक भ्रूण से सभी कक्षों को हटाने के वर्णन. एक uncoated कांच coverslip पर एक छोटे से मध्यम (मैं 5) के ड्रॉप में प्रत्येक embyro से कोशिकाओं dispersing के लिए विधि का प्रदर्शन है. माइक्रोस्कोप के माध्यम से चढ़ाना के बाद एक घंटे में एक दृश्य पसंदीदा सेल घनत्व दिखाता है. कोशिकाओं है कि जीवित जब परिभाषित माध्यम से हो के अधिकांश neuroblasts है कि 12-24 घंटे के द्वारा neuritic प्रक्रियाओं के विस्तार से पहले संस्कृति में एक या एक से अधिक बार विभाजित कर रहे हैं. माइक्रोस्कोप के माध्यम से एक दृश्य neurite परिणाम के स्तर को दिखाता है और इन विट्रो में 2 दिन में एक स्वस्थ संस्कृति में उम्मीद की शाखाओं में बंटी है. संस्कृतियों को एक सरल परिभाषित मध्यम आधारित बिकारबोनिट में बड़े हो रहे हैं, 22-24 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में Neuritic प्रक्रियाओं पर पहले हफ्ते विस्तृत संस्कृति में जारी है और जब वे पड़ोसी कोशिकाओं वे अक्सर कार्यात्मक synaptic कनेक्शन फार्म से neurites के साथ संपर्क बनाने. इन संस्कृतियों में न्यूरॉन्स वोल्टेज gated सोडियम, कैल्शियम और पोटेशियम चैनलों एक्सप्रेस और विद्युत उत्तेजनीय हैं. यह संस्कृति प्रणाली आणविक आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि neuronal भेदभाव, excitability, और synapse गठन / समारोह को विनियमित अध्ययन के लिए उपयोगी है.
Protocol
Discussion
ड्रोसोफिला midgastrula चरण भ्रूण से तैयार संस्कृतियों में न्यूरॉन्स neuroblast व्यापारियों, जिनमें से कई इन विट्रो में भेदभाव से पहले विभाजित से उत्पन्न होती हैं. यह प्रणाली इस प्रकार neuronal विकास के बहुत प्रारंभिक चरणों (Rohrbaug…
Acknowledgements
यह काम NIH अनुदान NS27501 के द्वारा DKOD समर्थित किया गया. एक HHMI प्रोफेसर अनुदान से DKOD इस काम के लिए अतिरिक्त समर्थन करते हैं.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
| Transferrin | Reagent | Sigma | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
| Insulin | Sigma | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
| Selenium | Sigma | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| Progesterone | Sigma | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
| Petri dishes | ||||
| Cover-slips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
| Paper filter | Whatman | #1 | ||
| 10cc syringe | Tool |
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.
Referências
- Rohrbough, J., O’Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O’Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O’Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O’Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O’Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
