Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

Summary

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの一次ニューロン培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、重炭酸塩ベースの定義培地での生育の2日後に細胞を1めっき後の時間と分化した神経細胞を示す。神経細胞は電気的興奮性であり、シナプス結合を形成する。

Abstract

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの主ニューロン培養を行うための手順を示しています。漂白剤を使用して、胚とそのdechorionationを収集するための方法が実証されています。口の吸引管に接続されているガラスピペットを用いて、我々は、単一の胚からのすべてのセルの除去を示しています。コー​​ティングされていないガラスのカバースリップ上で培地の小さな（5リットル）ドロップに各embyroから細胞を分散させるための方法が示されている。めっき後の1時間での顕微鏡を使用してビューには、好ましい細胞密度を示しています。定義された培地中で増殖させた場合、生存細胞のほとんどは12-24時間で神経突起のプロセスを拡張する前に、文化に1回以上の分割神経芽です。顕微鏡を使用してビューには、神経突起伸長のレベルを示し、in vitroで2日間で健全な文化の中で期待分岐を。培養は22〜24℃、5％CO ₂インキュベーター中で、定義された培地をベースにシンプルな炭酸で栽培されています神経突起のプロセスは、文化としたとき、彼らはしばしば機能的なシナプス結合を形成する隣接セルからの神経突起と接触するように最初の週にわたって詳しく説明し続ける。これらの培養物における神経細胞は、電位依存性ナトリウム、カルシウム、カリウムチャネルを発現しており、電気的興奮性があります。この培養系は、ニューロンの分化、興奮性、およびシナプス形成/機能を調節する分子遺伝学的要因と環境要因を研究するために有用です。

Protocol

I.ショウジョウバエの胚のコレクション卵のコレクションプレートを準備 8グラムの寒天を加えて200mlのdH 2 Oを沸かす 50℃まで冷却 2ミリリットルエタノール、2mlの酢酸を追加トップス、35mmプラスチックシャーレに注ぐクールと4で気密容器° Cで保管約80枚になります酵母ペーストを準備する貼り形成するために水にFlei…

Discussion

midgastrula期胚から調製ショウジョウバエの培養では神経細胞はin vitroで分化に先立って分割しその多くが神経芽細胞の前駆体、から生じる。このシステムは、このように神経発達のごく初期の段階（Rohrbaughら、2003）で重要な遺伝的要因と環境要因の探査のためのユニークな機会を提供します。我々は、単純な定義の培地中で増殖させた神経細胞でも（;リーとOダウド、1999 Oダウド、1995）機能的なシナプス結?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.