Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

Summary

Denna video visar förberedelserna primära neuronala kulturer från midgastrula skede Drosophila embryon. Utsikt över levande kulturer visar celler 1 timme efter bordläggning och differentierade nervceller efter 2 dagar på tillväxten i ett definierat bikarbonat-baserat medium. Nervceller är elektriskt retbara och form synapsförbindelser.

Abstract

Denna video illustrerar förfarandet för primära neuronala kulturer från midgastrula skede Drosophila embryon. Metoderna för insamling av embryon och deras dechorionation använda blekmedel demonstreras. Använda ett glas pipett bifogas en mun sugrör, illustrerar vi avlägsnandet av alla celler från enstaka embryon. Metoden för spridning celler från varje embyro i en liten (5 l) droppe medium på ett obestruket glas täckglas visas. En vy genom mikroskop på 1 timme efter bordläggning illustrerar föredra celltäthet. De flesta av de celler som överlever när de odlas i definierat medium är neuroblaster som delar en eller flera gånger i kultur innan utvidga neuritic processer 12-24 timmar. En vy i mikroskopet visar nivån på neurite utväxt och förgrening förväntas i en sund kultur på 2 dagar in vitro. Kulturer odlas på ett enkelt bikarbonat baserat definierat medium, i en 5% CO ₂ inkubator vid 22-24 ° C. Neuritic processer fortsätter att utveckla under den första veckan i kultur och när de tar kontakt med neurites från närliggande celler som de ofta bildar funktionella synapsförbindelser. Nervceller i dessa kulturer uttrycker spänningskänsliga natriumkanaler, kalcium och kalium kanaler och är elektriskt retbara. Denna kultur-systemet är användbart för att studera molekylära genetiska och miljömässiga faktorer som reglerar neuronala differentiering, upphetsning och synaps bildning / funktion.

Protocol

I. Drosophila embryosamlingsgrupp Förbered plattor insamling av ägg Koka 200 ml dH 2 O med 8 g agar Kyl till 50 ° C Tillsätt 2 ml EtOH och 2 ml Ättiksyra Häll i 35 Petri mm plastskålar, toppar Kyl och förvara i lufttät behållare vid 4 ° C Gör cirka 80 plattor Förbered jäst pasta Lös Fleishmans aktiva bakning jästen i vattnet och bildar klistra Mikrovågsugn i 20-30 sekunder för att död…

Discussion

I Drosophila kulturer beretts av midgastrula stadium embryon nervceller uppstår neuroblast prekursorer, av vilka många delar före differentiering in vitro. Detta system ger alltså en unik möjlighet för utforskning av genetiska och miljömässiga faktorer viktiga i mycket tidiga faser av nervsystemets utveckling (Rohrbaugh et al., 2003). Vi har visat att nervceller som odlats i ett definierat enkla medel differentieras till elektriskt retbara nervceller som utgör också funktionella synapsförbindelser (O Dowd, 1995; Lee och O Dowd, 1…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.