Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

Summary

Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme kaplama 2 gün sonra bir bikarbonat tabanlı tanımlı bir ortamda büyüme ve farklı nöronlar sonra hücreler 1 saat gösteriyor. Nöronların elektriksel olarak uyarılabilen ve sinaptik bağlantıları formu.

Abstract

Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin yapmak için prosedür göstermektedir. Çamaşır suyu kullanarak embriyo ve kendi dechorionation toplama yöntemleri gösterilmektedir. Ağız emme borusu bağlı bir damlalıklı cam kullanarak, tüm hücreleri tek embriyolar kaldırılması göstermektedir. Kaplamasız bir cam lamel, orta (5 lt) küçük bir düşüş içine her embyro hücrelerini dağıtma yöntemi olduğunu göstermiştir. Kaplama 1 saat sonra mikroskop ile bir görünüm için tercih edilen bir hücre yoğunluğu göstermektedir. Tanımlanan orta büyüdüğü zaman hayatta hücrelerinin çoğu 12-24 saat nöritik süreçleri uzanan önce bir kez veya daha fazla kültür bölmek neuroblasts. Mikroskop aracılığıyla bir görünüm neurite akıbet seviyesini gösterir ve in vitro 2 gün sağlıklı bir kültür beklenen dallanma. Kültürleri, 22-24 ° C'de% 5 _CO 2 inkübatör tanımlanan orta tabanlı basit bir bikarbonat yetiştirilen Nöritik süreçleri kültürünün ilk haftasında ayrıntılı olarak devam etmek ve komşu hücrelerden genellikle fonksiyonel sinaptik bağlantıları formu neurites ile temas yaparken. Bu kültürlerin Nöronlar voltaj kapılı sodyum, kalsiyum ve potasyum kanalları ifade ve elektriksel olarak uyarılabilen. Bu kültür sistemi nöronal farklılaşma, heyecanlanma, ve sinaps oluşumu / fonksiyon düzenleyen moleküler genetik ve çevresel faktörlerin çalışmak için yararlıdır.

Protocol

I. Drosophila Embriyo Koleksiyonu Yumurta toplama plakaları hazırlayın 8 g agar ile kaynatın 200 ml dH 2 O Soğuk – 50 ° C 2 ml EtOH ve 2 ml asetik asit 35 mm plastik petri kaplarına, tops dökün Serin ve hava geçirmez bir kapta saklayın, 4 ° C Yaklaşık 80 plakalar yapar Maya macun hazırlayın Hamur oluşturmak için Fleishmans aktif pişirme maya su içinde çözülür Maya öldürmek içi…

Discussion

Midgastrula dönem embriyoların hazırlanan Drosophila kültürlerde nöronlar in vitro farklılaşma önce bölmek çoğu neuroblast öncüleri, ortaya çıkar. Bu sistem, böylece nöronal gelişiminin çok erken evrelerinde (Rohrbaugh ve ark, 2003) önemli genetik ve çevresel faktörlerin araştırılması için eşsiz bir fırsat sağlar. Biz, tanımlanmış basit bir ortamda yetişen nöronların elektriksel olarak uyarılabilen nöronların (Lee ve O Dowd, 1999 O Dowd, 1995) fonksiyonel sinaptik bağlantıları oluşturmak ayrım ol…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.