从石蜡包埋材料的遗传和表观遗传分析的DNA提取

Summary

本视频演示了从福尔马林固定石蜡包埋的材料DNA提取的协议。这是一个多天的过程中，水化组织切片用二甲苯deparaffinized，乙醇和蛋白酶K处理，净化和隔离随后的特定基因或全基因组分析的DNA。

Abstract

疾病的发生和发展的特点是频繁的遗传和表观遗传异常，包括染色体重排，拷贝数收益和损失与DNA甲基化。高通量，全基因组分析技术，如芯片，进展显着改善我们的能力，识别和检测这些具体的改动。然而，随着技术的不断提高，是一个限制因素仍然样品的质量和可用性。此外，后续的临床资料和疾病的结果往往是收集年后最初的标本采集。标本，通常福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），存储几年到几十年在医院存档。 DNA可高效和有效地回收石蜡包埋标本，如果应用适当的方法提取。妥善保存，保存的标本中提取高质量的DNA可以支持比较正常和病变组织和代遗传和表观遗传^签名 1的定量分析。从石蜡包埋样品，组织核心或显微切割组织中提取的DNA受到二甲苯处理，其中溶解的石蜡组织，然后再水化使用乙醇洗涤系列。随后消化蛋白酶K的裂解液，其中包含变性剂，如十二烷基硫酸钠硫酸钠（SDS），有^利于消化2除了蛋白质和核酸，如有害的酶。核酸纯化从组织裂解液使用的缓冲区饱和的苯酚和高速离心产生一个双相的解决方案。 DNA和RNA停留在上层水相，而蛋白质，脂类和多糖间和有机相隔离的。保留的水相和反复苯酚抽提生成一个干净的样品。继苯酚抽提，RNA酶A添加到消除污染的RNA。额外的苯酚抽提用RNase孵化一个用来删除任何剩余的酶。添加醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，和高速离心是用来沉淀的DNA和促进异丙醇去除。从降水的多余的盐会干扰随后的酶法检测，但可以从DNA，用70％乙醇洗涤，离心^重新颗粒的DNA 3中删除。 DNA是重新悬浮蒸馏水或缓冲液的选择，量化，并储存在-20 ° C随后，纯化的DNA可用于下游应用，其中包括，但不仅限于，PCR，阵列比较基因组杂交（CGH阵列），甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）和测序，允许组织/肿瘤样本的综合分析。

Protocol

<p class="jove_title"> 1。程序说明</p><ul><li>二甲苯和苯酚有毒化学品，并应在通风柜处理。使用前，请参阅材料安全数据表（MSDS）。</li><li>二甲苯溶解某些塑料，聚丙烯管，应该使用，因为他们能够容忍这些化合物。</li><li>特别提示可购买包含一个内部的炭塞。这可以防止任何橡胶成分溶解在吸管二甲苯。另外，可用于过滤嘴。</li></ul><p class="jove_title"> 2。石蜡去除</p><ol><li>在通风柜，加800μL的二甲苯（VWR，CABDH6216 – 4）包含一个5到15分钟，以溶解石蜡轻轻摇动摇杆你的标本和地点的标记管。</li><li>颗粒样品，在3分钟离心纺纱最高转速（14,000 rpm或16 000 XG）。仔细撤回二甲苯​​上清并丢弃在二甲苯废物处置聚丙烯管。要小心不要去打扰颗粒。</li><li>重复二甲苯清洗步骤1和2until石蜡完全溶解。这通常需要两到三个清洗，组织样本的大小而定。充分溶解后的样本会出现软，有时会失去其结构的完整性。样品的完整性，可以轻轻地用枪头评估。</li></ol><p class="jove_title"> 3。乙醇补液</p><ol><li> 800μl100％乙醇（V / V）分子生物学级乙醇，涡旋的添加，然后旋转14,000 RPM离心3分钟。删除乙醇上清，小心不要去打扰颗粒。</li><li> 70％的乙醇添加800μL（100％（V / V）乙醇蒸馏水稀释（DH₂ O）），旋涡，3分钟14000转的自旋。小心地取出乙醇上清。</li><li>添加800μL50％乙醇（100％（V / V）乙醇蒸馏水稀释（DH₂ O）），涡街，5分钟14000转的旋转。小心地取出尽可能多的乙醇吹打。要非常小心扰乱沉淀在这一点上完全水化的组织不会颗粒以及脱水组织。</li><li>后删除5分钟乙醇上清液，空气干燥的颗粒，注意不要过度干燥。</li></ol><p class="jove_title"> 4。组织消化</p><ol><li>加入200-500微升裂解液（公式如下）。重新悬浮颗粒使用枪头或一个旋涡。额外的努力，在这一点上完全重新组织暂停会导致在一个更完整的样本的消化和更好的收益率的DNA。</li><li>孵育样品在56 ° C在水浴或加热块。</li><li>组织核心，穗20μL蛋白酶K（20毫克/毫升原液，Invitrogen公司，AM2548）早上和傍晚。</li><li>重复上述2至5天的消化步骤，直到该组织是完全溶解。</li></ol><p class="jove_step">细胞裂解液</p<ul><li> 10毫米的Tris – HCl pH值8.0</li><li> 100毫米EDTA pH值8.0</li><li> 50 mM氯化钠</li><li> 0.5％SDS</li><li> 200μg/ ml的蛋白酶K（使用前添加）</li></ul><p class="jove_title"> 5。 DNA的清洁</p><ol><li>饱和酚（费舍尔，BP1750I – 400）和颠倒混合，加入同等体积的缓冲。至少5分钟的转速14,000 RPM离心。</li><li>水层转移到新管。注意相间：有很多白色物质？</li><li>的水的一小部分，重复步骤1和2，直到相间清除（通常为3个或更多次）。执行回拔牙时相间是模糊的，以增加最终产量。</li><li>一旦相间是明确的，加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（费舍尔，BP1752I – 400）您的样品中提取的水分数。混合5分钟，然后5分钟转速在14000转。 Thisreduces残留的苯酚，并进一步提高相间，便于提取的水层</li><li>删除到一个新的管水层和treatwith RNA酶A为1小时100微克/毫升在37 ° C。</li><li重复步骤1至4删除任何剩余的RNA酶A和收集水的一小部分。你应该只需要1或2的缓冲区饱和酚步骤应该有少得多的蛋白质比初始裂解删除。</li></ol><p class="jove_content"*要执行回提取添加50-100μl生署₂ 0包含相间和有机部分样品管。反转管结构，在一个5分钟的离心14,000 rpm的旋转样品。收集水相，将它添加到以前获得的水提取。继续回到提取，直到相间是明确的。</p><p class="jove_title"> 6。 DNA沉淀</p><ol><li>估计你收集的水层的体积。</li><li>添加1 / 10的3 M醋酸钠pH值5.2的体积和1体积的异丙醇100％（V / V）的分子生物学级（100％乙醇或2.5卷）。</li><li>搅拌均匀，在冰上或在-20 ° C冰箱放30分钟或过夜。</li><li>旋转的最大速度（14,000 RPM）在4 ° C离心10分钟</li><li>弃上清。</li><li> 70％冰冷的乙醇，以消除不必要的盐洗净沉淀。</li><li>重新悬浮颗粒（通常是卫生署在缓冲区的选择₂ O）。</li></ol><p class="jove_title"> 7。 DNA定量</p><ol><li>量化的DNA的浓度。 A260：A280的比例应为〜1.8。对于少量的DNA，使用NanoDrop分光光度计的测量是首选。</li><li>以下定量，凝胶电泳应进行测试的样本DNA的质量，并确定是否已被污染的RNA完全降解。</li><li>高品质提取的DNA现在是适合下游的应用，或可在-20 ° C储存供日后使用。如果RNA仍然是你的样品中存在重复的DNA清理和沉淀步骤，重新量化和限定样品的质量。</li></ol>

Discussion

病理组织学分析和诊断组织活检或手术切除往往福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）长期贮存。随着越来越大的兴趣，了解疾病的遗传基础，能够从这些样本中提取DNA的诊断材料，可用于基因组分析和翻译研究的宝贵源泉。从历史上看FFPE样品不被认为是分子生物学分析的可靠来源，可能受到核酸蛋白核酸和蛋白质- ^蛋白质连接6跨修改。然而，发现蛋白酶消化释放支离破碎核酸适合下游分析，包括阵列比较基因组杂交，PCR，测序和甲基化分析，使这些宝贵的标本的^遗传分析6。

从石蜡包埋组织DNA提取是一个强大的的程序，对差的溶解度，以净化DNA依赖。提取的DNA质量和数量以及随后的DNA扩增的成功是依赖于许多参数之前，期间和之后提取。这些包括但不限于：组织的类型和数量，用于组织保存类型的固定液，固定期限，蜡块和储存条件年龄，以及所需的DNA片段的长度放大^1,7。切除石蜡组织是成功提取的最关键的一步，为不溶性的石蜡样品的质量差和抑制PCR扩增。

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–