Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Summary

Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.

Abstract

Desarrollo de la enfermedad y la progresión se caracteriza por frecuentes aberraciones genéticas y epigenéticas como reordenamientos cromosómicos, las ganancias y las pérdidas del número de copias y la metilación del ADN. Los avances en alto rendimiento, tecnologías de perfilado todo el genoma, como los microarrays, han mejorado significativamente nuestra capacidad para identificar y detectar esas alteraciones específicas. Sin embargo, como la tecnología continúa mejorando, sigue siendo un factor limitante de la calidad de la muestra y la disponibilidad. Información clínica, además, el seguimiento y la evolución de la enfermedad se recogen a menudo años después de la recolección de la muestra inicial. Muestras, por lo general fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE), se almacenan en los archivos del hospital durante años o décadas. ADN puede ser eficiente y eficaz se recuperó de las muestras incluidas en parafina, si el método adecuado de extracción se aplica. ADN de alta calidad extraído de muestras de adecuada conservación y almacenados pueden apoyar los ensayos cuantitativos para la comparación de los tejidos normales y enfermos y la generación de firmas genéticas y epigenéticas ^1. Para extraer el ADN de las muestras incluidas en parafina, las muestras de tejido o tejido microdissected son sometidos a un tratamiento xileno, que se disuelve la parafina de los tejidos, y luego rehidratado con una serie de lavados de etanol. Proteínas y enzimas perjudiciales como nucleasas son posteriormente digeridos por proteinasa K. La adición de tampón de lisis, que contiene agentes desnaturalizantes como el dodecilsulfato sódico (SDS), facilita la digestión ^2. Los ácidos nucleicos son purificados a partir del lisado de tejido con buffer saturado de velocidad de centrifugado de alta fenol y que genera una solución bifásica. ADN y ARN permanecen en la fase acuosa superior, mientras que las proteínas, lípidos y polisacáridos son secuestradas en las inter-fases y orgánicos, respectivamente. La retención de la fase acuosa y se repite extracciones con fenol genera una muestra limpia. Después de una extracción con fenol, RNasa A se añade para eliminar la contaminación de ARN. Adicionales extracciones con fenol después de la incubación con RNasa A se utilizan para eliminar cualquier resto de la enzima. La adición de acetato de sodio y el ADN precipita isopropanol, y centrifugación de alta velocidad se utiliza para precipitar el ADN y facilitar la eliminación de isopropanol. El exceso de sales prorrogados de precipitación pueden interferir con la consiguiente ensayos enzimáticos, pero se puede quitar a partir del ADN mediante el lavado con etanol al 70%, seguido de centrifugación para volver a la pastilla de ADN ^3. ADN se resuspendió en agua destilada o el buffer de la elección, cuantificado y almacenado a -20 ° C. ADN purificado posteriormente se puede utilizar en aplicaciones posteriores que incluyen, pero no se limitan a, PCR, hibridación genómica comparada serie ⁴ (CGH array), inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) y la secuenciación, lo que permite un análisis integral de las muestras de tejido / tumor.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. NOTAS DE LOS PROCEDIMIENTOS</p><ul><li> El xileno y el fenol son los productos químicos tóxicos y deben ser manejados en un fumehood. Consulte la hoja de datos de seguridad (MSDS) antes de su uso.</li><lixileno> disuelve algunos tipos de plástico, tubos de polipropileno debe ser utilizado como toleran estos compuestos.</li><liconsejos> especiales se pueden comprar que contienen un tapón de carbón interno. Esto evita que el xileno de la disolución de los componentes de goma en la pipeta. Por otra parte, puntas con filtro se puede utilizar.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Eliminación de parafina</p><ol><li> En un fumehood, añadir 800 l de xileno (VWR, CABDH6216-4) en el tubo rotulado, con su muestra y colocar en un eje de balancín con agitación suave durante 5 a 15 minutos para disolver la parafina.</li><li> Pellet la muestra girando a la velocidad máxima (14.000 rpm o 16 000 xg) en una microcentrífuga durante 3 minutos. Saque con cuidado el sobrenadante xileno y disponer en un tubo de polipropileno para desechar los residuos en el xileno. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento.</li><li> Repita los pasos 1 y xileno lavado de parafina 2until se disolvió completamente. Esto por lo general requiere de dos a tres lavados, dependiendo del tamaño de la muestra de tejido. Una muestra totalmente disuelto aparecerá suave, y algunas veces perder su integridad estructural. La integridad de la muestra puede ser evaluado con cuidado con una punta de la pipeta.</li></ol><p class="jove_title"> 3. El etanol de rehidratación</p><ol><li> Añadir 800 l de etanol al 100% (v / v) de grado de biología molecular del etanol, vórtice, gira la rueda durante 3 minutos a 14.000 rpm en microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante etanol, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.</li><li> Añadir 800 l de etanol al 70% (100% (v / v) de etanol diluido en agua destilada (dH₂ O)) y agitar, girar y durante 3 minutos a 14.000 rpm. Retire con cuidado el sobrenadante etanol.</li><li> Añadir 800 l de etanol al 50% (100% (v / v) de etanol diluido en agua destilada (dH₂ O)), vórtice, y girar durante 5 minutos a 14.000 rpm. Retire con cuidado el etanol tanto como sea posible con la pipeta. Tenga mucho cuidado de perturbar el precipitado en este momento como el tejido está completamente hidratada no pellet, así como los tejidos deshidratados.</li><li> Después de eliminar el sobrenadante de etanol, secar al aire el precipitado durante 5 minutos, teniendo cuidado de no más de seco.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Tejido digestión</p><ol><li> Añadir 200-500 l de buffer de lisis (fórmula abajo). Vuelva a suspender el pellet con una pipeta o un vórtice. Esfuerzo adicional en este punto para volver a suspender totalmente el tejido dará como resultado una digestión más completa de la muestra y un mejor rendimiento de ADN.</li><li> Se incuban las muestras a 56 ° C en un baño de agua o un calentador.</li><li> Para los núcleos de tejido, pico 20 l de proteinasa K (20 mg / ml de solución stock, Invitrogen, AM2548) mañana y tarde.</li><li> Repita los pasos anteriores para la digestión de 2 a 5 días hasta que el tejido esté totalmente disuelto.</li></ol><p class="jove_step"> Tampón de lisis</p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li><li> 100 mM EDTA pH 8,0</li><li> 50 mM NaCl</li><li> SDS al 0,5%</li><li> 200 mg / ml de proteinasa K (añadir justo antes de usar)</li></ul><p class="jove_title"> 5. ADN de limpieza</p><ol><li> Añadir un volumen igual de buffer de fenol saturado (Fisher, BP1750I-400) y mezclar por inversión. Girar por lo menos 5 minutos a 14.000 rpm en microcentrífuga.</li><li> Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Nota de la interfase: hay una gran cantidad de material blanco?</li><li> Repita los pasos 1 y 2 de la fracción acuosa hasta que la interfase está claro (por lo general tres o más veces). Realizar extracciones de nuevo * cuando la interfase es difusa para aumentar el rendimiento final.</li><li> Una vez que la interfase es clara, añadir un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) a la fracción acuosa se extrajo de la muestra. Mezclar durante 5 minutos y luego girar durante 5 minutos a 14.000 rpm. Thisreduces fenol residual y agudiza aún más la interfase, lo que facilita la extracción de la capa acuosa</li><li> Eliminar la capa acuosa a un tubo nuevo y treatwith RNasa A a 100 mg / ml durante 1 hora a 37 ° C.</li><li> Repita los pasos 1 a 4 para eliminar cualquier resto de RNasa A y recoger la fracción acuosa. Sólo es necesario un buffer o dos pasos de fenol saturado, ya que debe ser proteína y mucho menos de eliminar que en el lisado inicial.</li></ol><p class="jove_content"> * Para realizar extracciones de nuevo añadir 50-100 l de dH₂ 0 para el tubo de muestra con la interfase y la parte orgánica. Invierta el tubo para mezclar, y girar la muestra a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 5 minutos. Recoger la fase acuosa y añadir a la extracción acuosa previamente adquiridos. Continúa tu camino hasta que la extracción de la interfase es clara.</p><p class="jove_title"> 6. ADN precipitación</p><ol><li> Estimación del volumen de la capa acuosa recogidos.</li><li> Añadir 1 / 10 del volumen de 3 M de acetato de sodio pH 5,2 y un volumen de 100% de isopropanol (v / v) de calidad para biología molecular (o 2,5 volúmenes de etanol al 100%).</li><li> Mezclar bien y colocar en hielo o en un congelador a -20 ° C durante 30 minutos o toda la noche.</li><ligiro> a la máxima velocidad (14.000 rpm) a 4 ° C en microcentrífuga durante 10 minutos</li><li> Eliminar el sobrenadante.</li><li> Lavar el sedimento con etanol 70% frío de hielo para eliminar las sales no deseadas.</li><li> Vuelva a suspender el precipitado en el tampón de su elección (por lo general dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. Cuantificación del ADN</p><ol><li> Cuantificar la concentración de ADN. El A260: A280 relación debe ser ~ 1,8. Para pequeñas cantidades de ADN, medida con un espectrofotómetro NanoDrop se prefiere.</li><liCuantificación> Después, electroforesis en gel se debe realizar para poner a prueba la calidad de su muestra de ADN y determinar si la contaminación del ARN se ha degradado completamente.</li><li> Alta calidad del ADN extraído ahora es adecuada para aplicaciones posteriores, o puede ser almacenado a -20 ° C para su uso posterior. Si el ARN está presente en la muestra, repita el ADN de limpieza y etapas de precipitación, y volver a cuantificar y calificar la calidad de sus muestras.</li></ol>

Discussion

Tejidos biopsia o extirpado quirúrgicamente para el análisis histopatológico y el diagnóstico son a menudo fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE) para el almacenamiento a largo plazo. Con el creciente interés en la comprensión de las bases genéticas de la enfermedad, la capacidad de extraer el ADN de estas muestras representa una valiosa fuente de material de diagnóstico que pueden ser utilizados para el análisis genómico y los estudios de traducción. Históricamente muestras FFPE no fueron considerados una fuente viable para el análisis molecular de los ácidos nucleicos puede ser muy modificado por el ácido nucleico y proteína-proteína-proteína transversal que une ^6. Sin embargo, el descubrimiento de que la digestión de la proteasa versiones fragmentadas ácidos nucleicos que son adecuados para análisis posteriores como PCR, CGH array, la secuenciación y perfiles de metilación, permite el uso de estos valiosos ejemplares para el análisis genético ^6.

Extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina es un procedimiento sólido que se basa en la solubilidad diferencial para purificar el ADN. Calidad y cantidad de ADN extraído y el éxito de la amplificación de ADN posterior depende de una serie de parámetros antes, durante y después de la extracción. Estos incluyen, pero no se limitan a: el tipo y la cantidad de tejido, el tipo de fijador utilizado para la preservación de los tejidos, la duración de la fijación, la edad del bloque de parafina y las condiciones de almacenamiento, así como la longitud del segmento de ADN que se desea amplificada ^1,7. La eliminación de la parafina de los tejidos es el paso más crítico para la extracción de éxito como la parafina disuelta hace que la calidad de la muestra pobre y la inhibición de la amplificación por PCR.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–