Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Summary

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Abstract

Desenvolvimento da doença e progressão são caracterizados por freqüentes aberrações genéticas e epigenéticas, incluindo rearranjos cromossômicos, os ganhos e perdas no número de cópias e metilação do DNA. Avanços em alto rendimento, tecnologias genome-wide perfis, tais como microarrays, têm melhorado significativamente nossa capacidade de identificar e detectar essas alterações específicas. No entanto, como tecnologia continua a melhorar, continua sendo um fator limitante da qualidade da amostra e disponibilidade. Além disso, informações de acompanhamento clínico e prognóstico da doença são muitas vezes coletados anos após a coleta da amostra inicial. Espécimes, normalmente fixado em formalina e incluídos em parafina (FFPE), são armazenados em arquivos hospital por anos a décadas. DNA pode ser eficiente e eficaz recuperado de parafina espécimes se o método adequado para a extração é aplicada. DNA extraído de alta qualidade a partir de amostras devidamente preservados e armazenados pode suportar ensaios quantitativos para comparações de tecidos normais e doentes e geração de assinaturas genéticas e epigenéticas ^1. Para extrair o DNA de amostras de parafina, fragmentos de tecido ou tecido microdissecção são submetidos a tratamento xileno, que dissolve a parafina do tecido, e depois reidratados usando uma série de lavagens de etanol. Proteínas e enzimas prejudiciais, tais como nucleases são posteriormente digeridos por proteinase K. A adição de tampão de lise, que contém agentes desnaturantes, como dodecil sulfato de sódio (SDS), facilita a digestão ^2. Ácidos nucléicos são purificados a partir do lisado dos tecidos usando tampão saturada centrifugação velocidade fenol e alta, que gera uma solução bifásica. DNA e RNA permanecem na fase aquosa superior, enquanto que as proteínas, lipídios e polissacarídeos são seqüestrados na inter-orgânicos e fases, respectivamente. Retenção da fase aquosa e repetidas extrações fenol gera uma amostra limpa. Após extrações fenol, RNase A é adicionado para eliminar RNA contaminantes. Extrações adicionais fenol seguintes incubação com RNase A são utilizados para remover qualquer enzima restantes. A adição de acetato de sódio e isopropanol DNA precipita, e centrifugação de alta velocidade é usada para sedimentar o DNA e facilitar a remoção isopropanol. Excesso de sais transitadas de precipitação podem interferir com a subseqüente ensaios enzimáticos, mas pode ser removida do DNA por lavagem com etanol 70%, seguido por centrifugação a re-pellet o DNA ^3. DNA é re-suspensas em água destilada ou a reserva de escolha, quantificado e armazenado a -20 ° C. DNA purificado pode posteriormente ser utilizado em aplicações a jusante, que incluem, mas não estão limitados a, PCR, matriz hibridização genômica comparativa ⁴ (array CGH), imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP) e seqüenciamento, permitindo uma análise integrada de amostras de tecido / tumor.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Notas processuais</p><ul><li> Xileno e fenol são produtos químicos tóxicos e devem ser tratadas em um fumehood. Consulte a folha de dados material de segurança (MSDS) antes de usar.</li><lixileno> dissolve certos plásticos, tubos de polipropileno devem ser utilizados como eles toleram estes compostos.</li><li> Dicas especiais podem ser adquiridos que contêm uma rolha de carvão interno. Isso evita que o xileno de dissolver todos os componentes de borracha na pipeta. Alternativamente, filtros podem ser utilizados.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Remoção de parafina</p><ol><li> Em um fumehood, adicione 800 mL de xileno (VWR, CABDH6216-4) para o tubo rotulado contendo o seu exemplar e coloque sobre um roqueiro, agitando suavemente por 5 a 15 minutos para dissolver a parafina.</li><li> Pellet a amostra girando à velocidade máxima (14.000 rpm ou 16 000 xg) em microcentrífuga por 3 minutos. Retire cuidadosamente o sobrenadante xileno e dispor em um tubo de polipropileno para descarte dos resíduos xileno. Tenha cuidado para não perturbar o sedimento.</li><li> Repita os passos de lavagem xileno 1 e parafina 2until é completamente dissolvido. Isso geralmente requer 2-3 lavagens, dependendo do tamanho da amostra de tecido. Uma amostra completamente dissolvido aparecerá macio, e, às vezes, perder a sua integridade estrutural. A integridade da amostra pode ser avaliada com cuidado com uma ponta da pipeta.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Reidratação etanol</p><ol><li> Adicionar 800 mL de etanol a 100% (v / v) grau de biologia molecular do etanol vortex, em seguida, girar por 3 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga. Retire o sobrenadante etanol, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.</li><li> Adicionar 800 mL de etanol 70% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH₂ O)) vortex, e girar por 3 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o sobrenadante etanol.</li><li> Adicionar 800 mL de etanol 50% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH₂ O)) vortex, e girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o etanol tanto quanto possível, por pipetagem. Ser extremamente cuidadosa de perturbar o sedimento neste momento como o tecido completamente reidratadas não pellet, assim como tecido desidratado.</li><li> Depois de remover o sobrenadante etanol, secar o pellet por 5 minutos, sendo o cuidado de não mais seca.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Digestão dos tecidos</p><ol><li> Adicionar 200-500 mL de tampão de lise (fórmula abaixo). Re-suspender o pellet utilizando uma ponteira ou um vórtice. Esforço extra neste momento para re-suspender completamente o tecido irá resultar em uma digestão mais completa da amostra e um melhor rendimento de DNA.</li><li> Incubar as amostras a 56 ° C em banho-maria ou bloco de aquecimento.</li><li> Para fragmentos de tecido, ponto 20 l de proteinase K (20 mg / ml solução estoque, Invitrogen, AM2548) de manhã e à noite.</li><li> Repita os passos acima digestão de 2 a 5 dias até que o tecido é completamente dissolvido.</li></ol><p class="jove_step"> Tampão de Lise</p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li><li> 100 mM EDTA pH 8,0</li><li> 50 mM NaCl</li><li> SDS 0,5%</li><li> 200 mg / ml proteinase K (adicione imediatamente antes da utilização)</li></ul><p class="jove_title"> 5. DNA limpar</p><ol><li> Adicionar um volume igual de tampão saturada de fenol (Fisher, BP1750I-400) e misturar por inversão. Rotação por pelo menos 5 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga.</li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Observe a interfase: existe uma grande quantidade de material branco?</li><li> Repita os passos 1 e 2 na fração aquosa até que a interfase é claro (geralmente três ou mais vezes). Realizar extrações de volta * quando a interfase é distorcido para aumentar o rendimento final.</li><li> Uma vez que a interfase é claro, adicionar igual volume de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) para a fração aquosa extraída de sua amostra. Misturar por 5 minutos e depois girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Thisreduces residual de fenol e ainda aguça a interfase, facilitando a extração da camada aquosa</li><li> Retire a camada aquosa para um novo tubo e treatwith RNase A a 100 mg / ml durante 1 hora a 37 ° C.</li><li> Repita os passos 1-4 para remover qualquer RNase remanescentes A e recolher a fração aquosa. Você só deve precisar de 1 ou 2 tampão saturada passos fenol como deve haver muito menos proteína para remover do que no lisado inicial.</li></ol><p class="jove_content"> * Para realizar extrações de volta adicionar 50-100 mL de dH₂ 0 para o tubo de amostra contendo a interfase ea parte orgânica. Inverter o tubo para misturar, e girar a amostra a 14.000 rpm em microcentrífuga por cinco minutos. Coletar a fase aquosa e adicioná-lo à extração aquosa adquiridos anteriormente. Continue até a volta extrações interfase é clara.</p><p class="jove_title"> 6. DNA precipitação</p><ol><li> Estime o volume de sua camada aquosa recolhida.</li><li> Adicione 1 / 10 do volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1 volume de 100% de grau de biologia isopropanol (v / v) molecular (ou 2,5 volumes de etanol 100%).</li><li> Misture bem e coloque em gelo ou em um freezer -20 ° C por 30 minutos ou durante a noite.</li><li> Spin na velocidade máxima (14.000 rpm) a 4 ° C em microcentrífuga por 10 minutos</li><li> Descartar o sobrenadante.</li><li> Lave o pellet com etanol 70% de gelo fria para remover sais indesejados.</li><li> Re-suspender o pellet no buffer de escolha (geralmente dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. Quantificação de DNA</p><ol><li> Quantificar a concentração de DNA. O A260: A280 relação deve ser ~ 1.8. Para pequenas quantidades de DNA, medição utilizando um espectrofotômetro NanoDrop é o preferido.</li><li> Após a quantificação, eletroforese em gel devem ser realizados para testar a qualidade do seu DNA de amostras e determinar se a contaminação RNA foi completamente degradada.</li><li> Alta qualidade de DNA extraído é agora adequado para aplicações a jusante, ou podem ser armazenadas a -20 ° C para uso posterior. Se RNA ainda está presente na sua amostra, repetir o DNA e as etapas de limpeza, precipitação e re quantificar e qualificar a qualidade de suas amostras.</li></ol>

Discussion

Tecidos biopsiados ou extirpado cirurgicamente para análise histopatológica eo diagnóstico muitas vezes são fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) para o armazenamento de longo prazo. Com o crescente interesse na compreensão da base genética da doença, a capacidade de extrair DNA dessas amostras representam uma valiosa fonte de material de diagnóstico que pode ser usado para a análise genômica e estudos translacionais. Amostras historicamente FFPE não foram consideradas uma fonte viável para a análise molecular de ácidos nucléicos podem ser pesadamente modificadas por ácido nucléico e proteína-proteína-proteína reticulação ^6. No entanto, a descoberta de que a digestão protease releases fragmentada ácidos nucléicos que são adequados para análises a jusante, incluindo PCR, CGH array, seqüenciamento e perfil de metilação, permite o uso destes espécimes valiosos para a análise genética ^6.

Extração de DNA de tecidos incluídos em parafina é um procedimento robusto que depende de solubilidade diferencial para purificar DNA. Qualidade do DNA extraído ea quantidade eo sucesso da amplificação do DNA subseqüente é dependente de um número de parâmetros antes, durante e após a extração. Estes incluem, mas não estão limitados a: tipo e quantidade de tecido, o tipo de fixador utilizado para preservação de tecido, a duração da fixação, a idade do bloco de parafina e as condições de armazenagem, bem como o comprimento do segmento de DNA que se deseja amplificado ^1,7. Remoção de parafina do tecido é a etapa mais crítica para a extração de sucesso como a parafina não dissolvido leva a qualidade da amostra pobres e inibição da PCR.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–