Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

Summary

Это видео демонстрирует протокол для выделения ДНК из фиксированных формалином парафин материала. Это многодневных процедура, при которой ткань разделы deparaffinized с ксилол, регидратации с этанолом и обрабатывают протеиназы К, чтобы очистить и изолировать ДНК для последующего гена или конкретной генома анализа.

Abstract

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures ¹. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion ². Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA ³. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20°C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization ⁴ (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Замечания по процедуре</p><ul><li> Ксилол и фенол являются токсичными химическими веществами и должны содержаться в fumehood. См. данные о безопасности материала (MSDS) перед использованием.</li><li> Ксилол растворяет некоторых пластмасс, полипропиленовые трубы должны быть использованы, как они переносят эти соединения.</li><li> Специальные советы могут быть приобретены, которые содержат внутреннюю пробку углем. Это предотвращает ксилола от разрыва каких резиновых деталей в пипетку. Кроме того, фильтр советы могут быть использованы.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Очистка от парафина</p><ol><li> В fumehood, добавьте 800 мкл ксилол (VWR, CABDH6216-4) с меченым пробирку, содержащую ваш образец и место на рокера с нежным встряхивания в течение 5 до 15 минут для растворения парафина.</li><li> Пеллет образца спиннинг на максимальной скорости (14 000 оборотов в минуту или 16 000 мкг) в микроцентрифужных течение 3 минут. Аккуратно снять ксилол супернатант и распоряжаться в полипропиленовые трубы для отбросить в ксилоле отходов. Будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок.</li><li> Повторить шаги ксилол мыть 1 и 2until парафин полного растворения. Это обычно требует 2:58 моет, в зависимости от размера образца ткани. Полного растворения образца появятся мягкие, а иногда теряет свою структурную целостность. Целостность образца может быть аккуратно оценивать с кончика пипетки.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Этанол регидратации</p><ol><li> Добавить 800 мкл 100% этанола (об. / об) молекулярной биологии этанол, вихревые, то спина в течение 3 минут при 14000 оборотов в минуту в микроцентрифужных. Удалить супернатант этанола, стараясь не потревожить осадок.</li><li> Добавить 800 мкл 70% этанола (100% (об. / об) этанол разводят в дистиллированной воде (дН₂ O)), вихревые, и спина в течение 3 минут при 14000 оборотах в минуту. Осторожно удалите супернатант этанола.</li><li> Добавить 800 мкл 50% этанола (100% (об. / об) этанол разводят в дистиллированной воде (дН₂ O)), вихревые, и спина в течение 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Осторожно удалить как можно больше этанола в качестве возможных с помощью пипетки. Будьте крайне осторожны в нарушении гранул в этот момент как полностью регидратации тканей не будет гранул, а также обезвоженные ткани.</li><li> После удаления этанола супернатант, воздушно-сухих гранул в течение 5 минут, стараясь не более чем сухая.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Ткань пищеварения</p><ol><li> Добавить 200-500 мкл лизирующего буфера (формула ниже). Повторное приостановить осадок в наконечник пипетки или вихрь. Дополнительные усилия на данном этапе, чтобы полностью повторно приостанавливать ткани приведет к более полному усвоению образцов и лучший урожай ДНК.</li><li> Инкубируйте образцов при 56 ° С на водяной бане или нагрева блока.</li><li> Для ткани ядер, шипованные 20 мкл протеиназы К (20 мг / мл маточного раствора, Invitrogen, AM2548) утром и вечером.</li><li> Повторить выше пищеварение шагах от 2 до 5 дней, пока ткань полностью растворился.</li></ol><p class="jove_step"> Лизис буфера</p<ul><li> 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0</li><li> 100 мМ ЭДТА рН 8,0</li><li> 50 мМ NaCl</li><li> 0,5% SDS</li><li> 200 мкг / мл протеиназы К (добавить непосредственно перед употреблением)</li></ul><p class="jove_title"> 5. ДНК очистки</p><ol><li> Добавить равный объем буфера насыщенных фенола (Fisher, BP1750I-400) и микс от инверсии. Спиновые, по крайней мере, 5 минут при 14000 оборотов в минуту в микроцентрифужных.</li><li> Передача водный слой в новую пробирку. Обратите внимание на межфазной: есть много белого материала?</li><li> Повторите шаги 1 и 2 на водном долю до межфазной ясно (как правило, 3 и более раза). Выполните назад извлечения * при межфазных размыто увеличить конечный выход.</li><li> После межфазной ясно, добавьте равное количество фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1) (Фишер, BP1752I-400) для извлечения водных часть своего образца. Смешайте в течение 5 минут, а затем спина в течение 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Thisreduces остаточной фенола и далее обостряет интерфазе, что облегчает извлечение водный слой</li><li> Удалить водный слой в новую пробирку и treatwith РНКазы при 100 мкг / мл в течение 1 часа при температуре 37 ° C.</li><li> Повторить шаги с 1 по 4 для удаления остатков РНКазы и собирать водные фракции. Вы должны достаточно 1 или 2 буфера насыщенных фенола шаги, как не должно быть гораздо меньше белка, чтобы удалить, чем в исходном лизат.</li></ol><p class="jove_content"> * Для выполнения резервного экстракции добавляют 50-100 мкл дН₂ 0 на образец трубки, содержащей интерфазе и органической частью. Обратить трубки перемешать, и спина образца при 14 000 оборотов в минуту в микроцентрифужных течение 5 минут. Сбор водной фазы и добавить его к ранее приобретенной водной экстракции. Продолжить назад извлечений до межфазной ясно.</p><p class="jove_title"> 6. ДНК осадков</p><ol><li> Оцените объем вашего собраны водный слой.</li><li> Добавить 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия рН 5,2 и 1 объемом 100% изопропанола (об. / об) молекулярной биологии класс (или 2,5 объема 100% этанола).</li><li> Хорошо перемешать и поставить на лед или в морозильной камере -20 ° C в течение 30 минут или на ночь.</li><li> Spin на максимальной скорости (14 000 оборотов в минуту) при 4 ° С в микроцентрифужных в течение 10 минут</li><li> Убрать супернатант.</li><li> Мойте гранул с 70% ледяной этанола для удаления нежелательных солей.</li><li> Re-приостановить пеллет в буфере выбора (как правило, дН₂ О).</li></ol><p class="jove_title"> 7. ДНК количественное</p><ol><li> Количественная концентрация ДНК. A260: A280 отношение должно быть ~ 1,8. Для небольших количеств ДНК, измерение с помощью NanoDrop спектрофотометр является предпочтительным.</li><li> После количественного определения, гель-электрофореза должны быть выполнены, чтобы проверить качество Вашего анализа ДНК и определения загрязняющих РНК была полностью деградировали.</li><li> Высокое качество извлечения ДНК, в настоящее время ниже по течению подходит для приложений, а также может храниться при температуре -20 ° C для дальнейшего использования. Если РНК-прежнему присутствует в вашей выборке, повторите ДНК очистки и осадки шаги, и вновь количественно и квалифицировать качество ваших образцов.</li></ol>

Discussion

Биопсии или хирургическим путем вырезали ткани для гистологического анализа и диагностики часто фиксированных формалином и залитые парафином (FFPE) для длительного хранения. С ростом интереса к пониманию генетической основы болезни, умение извлекать ДНК из этих образцов представляет бесценный источник диагностического материала, который может быть использован для геномного анализа и поступательное исследований. Исторически FFPE образцы не считается жизнеспособным источником для молекулярного анализа, как нуклеиновые кислоты могут быть сильно изменены белково-нуклеиновых и белок-белковые сшивки ^6. Тем не менее, открытие, что протеазы пищеварения релизы фрагментирован нуклеиновых кислот, которые подходят для последующих анализов, включая ПЦР, массив CGH, последовательность и метилирования профилирование, позволяет использовать эти ценные образцы для генетического анализа ^6.

Экстракции ДНК из парафиновых срезах тканей является надежной процедурой, которая опирается на дифференциальные растворимости для очистки ДНК. Извлеченные качества ДНК и количество и успех последующей амплификации ДНК зависит от ряда параметров до, во время и после экстракции. Они включают, но не ограничиваются: тип и количество ткани, тип фиксатора используется для сохранения ткани, длительность фиксации, возраст блок парафина и условий хранения, а также длину желаемого сегмента ДНК, чтобы быть усиливается ^1,7. Удаление парафина из тканей является наиболее важным шагом для успешного извлечения как нерастворенных парафина приводит к ухудшению качества образца и ингибирование ПЦР.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–