Summary
Mikobakterilerin numaralandırma için alternatif bir yaklaşım tarif
Abstract
Fonksiyonel testlerin uzun süre belirli bir aşı immünojenite ölçme önemli bir rol oynamıştır. Bu, geleneksel serum bakterisidal titreleri olarak ifade edilir. Çocukluk aşıları yanıt serum bakterisidal titreleri çalışmaları rutin olarak kullanılması, koruyucu bağışıklık yanıtlarını ve bu cut-off için seviyelerini geliştirmek ve cut-off doğrulamak sağlamıştır. Testler TB aşıları gibi efektör T hücre yanıtları şeklinde öncelikle hücre-aracılı bağışıklık neden olan aşıların rutin değerlendirme içine ileri atılmıştır. Hayvan modeli, belirli bir aşı adayı performans rutin standart bakterisidal tayinlerde değerlendirilir ve mevcut tüm roman TB aşı adayı 1 insan çalışmalarda faz önce bu adımı değerlendirilmesi maruz kalmış. Immünojenite ve bu nedenle yeni anti-TB aşıların koruyucu etkinlik olasılığını değerlendirme ideal bakterisidal testleri ölçümleri de dahil olmak üzere, insan modelleri benzer bir adım akıllıca değerlendirme geçmelidir.
Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri zaten iyi, hayvan modellerinde yılında kurulmuş olan. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması. Ancak, bugüne kadar yeni anti-TB aşıları için böyle testleri klinik çalışmalarda içine dahil edilmiştir.
Mikobakterilerin insan makrofaj içinde öldürülmesi neden tam mekanizmaları hakkında belirsizlik hala var olmasına rağmen, mikobakteriler ile makrofaj ve T hücrelerinin etkileşimi açıkça gereklidir. Bu yazıda anlatılan testi onların göreceli bireysel katkı hakkında varsayımlar yapmadan tam kan mevcut diğer tüm hücresel ve humoral faktörler gibi temel hücresel bileşenleri çalışmaları sağlar bakterisidal testlerinin bir roman neslini temsil ediyor. Grubumuz tarafından açıklanan tam kan tahlil küçük hacimlerde kullanır ve zaten TB-endemik ayarları yetişkinler ve çocuklar çalışmalarda istihdam edilmiştir. Biz, BCG aşısı immünojenite gösterilen mikobakterilerin büyüme, HIV-pozitif hastalarda mikobakteriyel sağkalım üzerine in vitro anti-retroviral tedavi ve D vitamini etkisinin yanı sıra artmıştır. Burada metodoloji özetlemekte ve bu nispeten basit, düşük maliyetli ve sahada dostu bir model kullanarak tekrarlanabilirlik veri mevcut.
Not: Tanımlar / Kısaltmalar
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal gerilme, mikobakteriyel GroEL (hsp60) promotör kontrolü altında, Vibrio harveyi luxAB genleri taşıyan servis plazmid pSMT1 dönüştürdü.
CFU = Koloni Oluşturan Birim (mikobakteriyel canlılığının bir önlem).
Protocol
1. BCG lüks muhabiri mikobakteriler stok hazırlanması
- BCG büyümeye lux Middlebrook 7H9 broth içeren% 0.2 gliserol,% 0.05 arasında 80 ve% 10 ADC zenginleştirme orta-logaritmik faz 200rpm az sallayarak (servis plazmid pSMT1 ile dönüştürülmüş M. bovis BCG Montreal suşu).
- Luminometre çift tüp (900μl PBS + 100μl BCG lüks kültür) 1ml steril PBS BCG lüks kültür 1:10 seyreltme hazırlayın.
- N-desil aldehit (luciferin enzim substratı) içeren tüp makine sırtına yük ve kapağı sabitleniyor ve tüpler sağlamak.
- Luminometreye yerleştirilen 3 boş emişli tüplerin her birine 100 ucl x 3 enjekte etmek için ana program üzerinden substrat ile Başbakan luminometre enjektör.
- Luminometre 2 tüpler içine yükleyin ve her tüp içine substrat 100 ucl enjekte bir program aracılığıyla okuma ve 1 sn aralıklarla 20 saniye boyunca okuyun.
- Stok 1x10 8 RLU / ml 2x10 8 RLU / ml (Bu büyüme 3-4 gün sürer) ulaştığında, 50ml şahin tüp kültür eşit hacimde steril% 30 gliserol ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- -80 Etiketli 2 ml vidalı kapaklı mikrotüp ve mağaza ° C içine kısım 1.5ml hacimleri
2. Belirlenmesi stok RLU / CFU korelasyon ve alikotları içeriği
- Havalandırmalı bir kap ile 200ml Erlenmeyer şişesinde% 10 ADC ek Middlebrook 7H9 kültür ortamı 15ml ekleyin.
- % 20 Tween hygromycin ve 30μl 15μl ekleyin.
- Güvenlik kabini, oda sıcaklığında (RT) dondurucu ve defrost BCG lüks bir şişe çıkarın . Orta flakon içeriğini ekleyin ve kapağını sıkın.
- 37 200rpm az sallayarak ° C'de 4 gün inkübe edin.
- Her gün makyaj CFU belirlenmesi için seri 10-kat dilüsyonları (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000 ve 1:100,000).
- Paralel olarak aynı dilüsyonları kurmak ve lüminesans belirlemek için (1.2-1.6) çoğaltmak.
- Middlebrook 7H11 agar (% 0.5 gliserol,% 10 OADC ek,% 20 Tween ve hygromycin, 1 ml 1 ml içeren sıvı bir ortamda 1 litre) 3 bölmesi iki tabak hazırlayın.
- Sıvı bireysel kamara arasında eşit şekilde dağıtarak, ayrı serpme kullanarak her plaka bir segment üzerine her seyreltme 100μl, dışarı Plaka.
- Parafilm her tabak, steril bir plastik torba yerine, otoklav bandı ile mühür Seal, ve 37 inkübe ° C, 2 hafta boyunca aşağı bakacak şekilde kapaklı.
- CFU (2-3 hafta) görünene kadar düzenli olarak kontrol edin.
- Koloniler saymak için, kuvöz ve bir koloni sayacı yer plakaları çıkarın. Yinelenen plakalardan her seyreltme için ortalama hesaplayın.
- Her seyreltme için eşdeğer RLU ve CFU sayıları kullanarak RLU / CFU oranını hesaplayın. Bu oran, 3 ve 5 RLU / CFU arasında olmalıdır.
3. Tam kan inokülasyon için BCG lüks kültür hazırlanması
- Havalandırmalı bir kap ile 200ml Erlenmeyer şişesinde% 10 ADC ek Middlebrook 7H9 kültür ortamı 15ml ekleyin.
- % 20 Tween hygromycin ve 30μl 15μl ekleyin.
- Güvenlik kabini RT dondurucu ve defrost BCG lüks bir şişe çıkarın. Orta flakon içeriğini ekleyin ve kapağını sıkın.
- 37 200rpm az sallayarak ° C 2 ila 4 gün inkübe edin.
- Luminometre çift tüp (900μl PBS + 100μl BCG lüks kültür) 1ml steril PBS BCG lüks kültür 1:10 seyreltme hazırlayın.
- Başbakan luminometre substrat ile (yukarıda açıklandığı gibi), 2 tüpler yavaşça girdap ve luminometre yüklemek ve okuma (yukarıda açıklandığı gibi) almak.
- 7x10 6 RLU eşdeğer (monosit sayısı varsayarak, 2x10 yaklaşık 5 CFU / ml kan ve BCG oranı 1:1 monositler için bir inokulum verecek vermek için PBS içinde kültür sulandırmak için bu okuma kullanın. kan ml başına 4x10 için yaklaşık 5 2x10, 5 monositler) .
4. Tam kan hazırlanması
- 3 alın, koruyucu içermeyen heparin içeren bir tüp 5ml venöz kan.
- 50ml şahin tüp kan transferi ve eşit miktarda glutamin ve 25mm Hepes (Herhangi bir kalem / strep) içeren RPMI 1640 ile seyreltilir .
- 0hrs için 3 ve 96hrs için 3, gerekirse ek timepoints için ek tüp ayarlayın: Her zaman noktası için steril küçük ama tüpleri (toplam 6 tüpler içine üç nüsha olarak seyreltilmiş kan kısım 900μl
- % 10 ADC takviyesi + 50μg/ml hygromycin (BCG lüks kültürü eskiden olduğu gibi aynı ortamda) Middlebrooks 7H9 kültür orta kısım 900μl büyümesini kontrol çoğaltın.
- Her bir tüp kan seyreltilmiş BCG lux, 100μl ekleyin ve 2 büyüme kontrolütüpler.
- İyice karıştırın ve 37 sallanan inkübatör kendi tarafında zaman 96hr noktası ve 2 büyümesini kontrol için 3 bijous ° C, 20 dev / dak (CO 2 gerekli değildir).
5. Ölçüm lüminesans (0hr ve 96hrs)
- 10 dakika 2000g 3 bijous santrifüjleyin.
- , -80 Dondurmak için 2 ml vidalı kapaklı mikrotüpler pelet ve yeri rahatsız etmeden dikkatlice süpernatant 300μl kaldırmak ° C, daha sonraki sitokin analiz için.
- Kaldırılır süpernatant hacmi yerine her küçük ama PBS 300μl ekleyin.
- Her küçük ama içeriğini ilgili 50ml şahin tüp içine aspire edin ve her tüp 8 ml distile su ekleyin. 10 dakika için bir zamanlayıcı başlayın.
Nb: Bu zamana duyarlı bir adım olduğunu ve bu kuluçka hücreleri ilk kez su ile temas ettiğinde itibaren, herhangi bir 10 dakika daha uzun olmamalıdır. - 2ml için distile su ve 5 saniye vorteks ile ilgili şahin tüpe devrilme önce her küçük ama durulayın.
- 10 dakikalık inkübasyon sonunda, 10 dakika için 2000g şahin tüpler santrifüj.
- Surfanios dezenfektan içine Durusu süpernatant.
- Her pelet ve vorteks birkaç cam boncuk ekleyin.
- 1ml steril PBS her tüp ve vorteks ekleyin.
- Luminometre tüplerde, PBS (900μl PBS + 100μl örnek) ile yinelenen ve 96hr zaman noktası, her bir örnek için 01:10 dilüsyonları olun. Büyüme kontrollerin her biri için aynı dilüsyonları olun.
- Yavaşça vorteks tüpleri ve luminometre yüklemek ve okuma (yukarıda açıklandığı gibi) almak
Nb: aynı örnek triplicates arasında Okumalar, biri diğerinin% 15 içinde olmalıdır .
6. Temsilcisi sonuçları:
Metabolik aktivite suboptimal olduğu gibi, yani önce örnekleri aşılamak için 48-72 saat içinde büyüdü, tam kan lüks deneyleri için büyüme logaritmik faz, bakteri kullanılması önemlidir dondurucu düz dışarı ya durumunda veya sabit faz . Önce büyüme değişkenliği önlemek için bir dizi deneyler ya da 48 veya 72 saat için standardize edilmelidir. Şekil 1 BCG lüks bir temsilcisi kültürünün büyüme eğrisi gösterir. Sabit faz ulaşana kadar iki katına çıkma süresi 24 saat.
Şekil 1: BCG Temsilcisi büyüme eğrisi lüks 7H9 orta ve RLU ve CFU korelasyon 96 saat içinde.
RLU değerleri her zaman CFU ile korele olsa da, tutarlı bir enfeksiyon çokluğu garanti etmek için bir dizi deney boyunca aynı donmuş stoğu kullanmak için iyi bir neden (tek bir CFU ilgili RLU sayısı, stok bağlı olarak değişebilir. İçişleri Bakanlığı).
Tablo 1, aşılama zamanı (T 0) ve 96 saat ham tarihten bir örnek gösterir . Büyüme oranları, formül T 96 / T 0 kullanılarak hesaplanır, ama başka zaman aralıkları içerisinde de ölçülebilir . Önemli hücre ölümü gerçekleşir gibi olur, ancak tavsiye, 96 saat ötesinde kültürlerin kullanmak için değil.
Tablo 1, aşılama (T0) süresi ve 96 saate kadar (T96) ve 3 erişkin vericilerden hesaplanan büyüme oranları ham veri örneği .
Mevcut antijen spesifik bellek yanıtları ve muhtemelen de nötrofil sayısı bağlı olarak, büyüme oranları, çocukların kan Şekil 2 ve HIV enfeksiyonu olmadan burada görüldüğü gibi, bireyler arasında değişir. Ortalama olarak, genç çocuklar yetişkinlere göre daha yüksek büyüme oranlarına sahip, Tüberkülin deri testi (TDT) + ve bireylerin TST-ve bireylerin daha düşük büyüme oranları ve HIV enfeksiyonlu hastalarda, CD4 T hücre popülasyonunun eksikliği nedeniyle yüksek büyüme oranlarına sahip mikobakteriler için hücresel immün yanıtları anahtar arabulucular biri.
Şekil 2 Inter-donör değişkenliği: altta yatan HIV durumuna bağlı olarak, hastaların bir dizi T 0'a karşı 96 saat Büyüme oranları.
Şekil 3, 12 aylık bir süre içinde ve kontrol deneyleri için tekrar tekrar kanadı tek bir donör iki kanadı 64 donörlerin sonuçları özetleyen bir süre içinde büyüme oranlarının Tekrarlanabilirlik gösterilmiştir. Değişkenlik potansiyel nedenleri gibi birçok biyoanalizlere gözlenen ana sitokinlerin düzeyleri içinde mikobakteriyel hassasiyete ya da değişkenlik değişiklikler olabilir.
Şekil 3. 12 ay içinde 12 kez (a) Tek donör 12 metreye kadar 2 kez (b) birden fazla (64) donörlerinonths.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri, hayvan modellerinde de kurulmuştur. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması.
M. enfekte insan bakterisidal testlerinin ilk nesil, tek başına makrofajlar kullanılarak dizayn edilmiştir tüberküloz. CFU, en az 3 haftalık bir süre sonra ana mikobakteriyel hayatta kalma okuma olarak görev yaptı. Bu testlerin verilen süre noktaları 1,2 PBMC, yapışık monositler / makrofajlar ve lizis hazırlanması dayanıyordu.
M. içeren makrofajlar ve T hücreleri arasında daha karmaşık etkileşimler bizim anlayış olarak tüberküloz evrildiğini ve manyetik boncuklar kullanarak çeşitli hücre popülasyonlarının ayrılması artık mümkün olduğunu, bu sistemlerin testleri geri T hücreleri ekleme ve ölçme CFU 3,4,5 modifiye edilmiştir. Bu testlerin bazıları canlı M. tüberküloz, ama M. ile çalışmak ana engellerden biri bakterisidal deneyleri tüberküloz, çevreleme tesisleri ve CFU kültür 3 hafta sonra sadece mevcut olduğu gerçeğini için ihtiyaç vardır . PBMC-bazlı testlerin yanı sıra, büyük miktarda kan gerektirir ve hala okuma, 3 hafta aldığı gibi CFU güveniyor.
Metabolik aktivite dayalı, daha hızlı okuma-çıkışları kolaylaştırmak için, yeni testlerin dizayn edilmiştir. Urasil birleşme ya da 4,5 ile son 10 yıl içinde dizayn edilmiştir yaşayabilir mikobakteriyel ve üç farklı sistemlerin uyumlu olarak bu testleri, metabolik aktivitesi ölçülür, muhabir-gen mikobakteriler 6-11 veya tagged / BACTEC üzeri radyometrik algılama sistemi MDGIT şişe 7,8.
Tam kan lüks testinin başarıyla TB-endemik ayarları transfer olmuştur ve çocuk 9,10 kullanılan bugüne kadar tek bir testtir. Ayrıca, başka hiçbir testi bir süre içinde içi donör değişkenlik verileri yayımladı.
Lüks testinin bir sınırlama Genetiği değiştirilmiş organizmalar konusunda güven ve kültür aşılama öncesinde organizmanın ihtiyacı. Ancak, organizmaların tam niceliği nedeniyle, karşılaştırılabilirlik ve tekrarlanabilirlik yardımcıları deneyler her dizi ve her parti için çok doğru bir enfeksiyon çokluğu hesaplamak mümkündür. Talimatları testinin başarılı bir şekilde uygulanması için gerekli olan hisse senetlerinin iyi canlılığı elde etmek için suşların hazırlanmasında yakından takip edilmesi gerekir. Taze kan tahlil yürütülen olduğundan, bu zamana duyarlı ve depolama alanında örnekleri mümkün değildir. İdeal olan, kan, 4 saat içinde laboratuar ulaşması gerekir. Bu gelecekte daha da gerekli kan miktarını azaltmak için mümkün olabilir, ve laboratuar şu anda bunun üzerinde çalışıyor.
Düşük maliyet ve uygulanabilirlik küçük örnekler göz önüne alındığında, bu testte, 10 ya da anti-TB müdahaleler 11 romanı TB aşıları klinik çalışmalarda içine entegre etmek teknik olarak mümkün . Bu aşı sadece konak yanıtı değerlendirmek için ek bir fırsat sağlayacak bir dizi immunolojik ve moleküler teknikler kullanarak (flow sitometri, ELISPOT ve mikroarray) geçerli bir uygulamadır, fakat fonksiyonel mikobakteriyel okumak eklemek için konak-patojen etkileşimi şu hayatta kalma. Bu hayvan modeli veya hücresel immün yanıtları dayanarak değil, başka enfeksiyonlar için serum inhibisyonu dayalı bakterisidal deneyleri ile klinik öncesi çalışmalarda aşı değerlendirmeler için yaygın bir uygulamadır.
Bu roman TB aşıları bu yaklaşımı uygulamak için zamanında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Wellcome Trust Beate Kampmann (056.608, GRO77273) için kişisel burslar tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
