الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T
Summary
نحن وصف وحيدة الخلية الإنتاجية العالية فحص لقياس السمسة من الخلايا T عندما حضنت مع الخلايا المستهدفة الورم. هذا الأسلوب يستخدم مجموعة كثيفة من اللدائن المرنة، من شبه نانولتر الآبار (آبار ~ 100،000 / مجموعة) لحصر الخلايا T مكانيا والخلايا المستهدفة في نسب محددة ويقترن إلى مضان المجهر لمراقبة المستجيب المستهدفة الاقتران وموت الخلايا المبرمج اللاحقة.
Abstract
يمكن علاج مناعي السرطان تسخير خصوصية الاستجابة المناعية لاستهداف والقضاء على الأورام. وقد أظهرت بالتبني العلاج بالخلايا (ACT) استنادا إلى نقل بالتبني من الخلايا T المعدلة وراثيا للتعبير عن مستقبلات مستضد خيالية (CAR) وعد كبير في التجارب السريرية 1-4. هناك العديد من المزايا لاستخدام الخلايا T + CAR لعلاج السرطان بما في ذلك القدرة على استهداف مستضدات غير مقيد MHC والخلايا T functionalize من أجل البقاء الأمثل، واستمرار صاروخ موجه داخل المضيف، وأخيرا للحث على موت الخلايا المبرمج للCAR + T الخلايا في حالة سمية المضيف 5.
ترسيم الوظائف الأمثل للخلايا T + CAR المرتبطة فائدة سريرية أمر ضروري لتصميم الجيل القادم من التجارب السريرية. التطورات الحديثة في مجال التصوير المجهري مثل الحيوانات الحية multiphoton أحدثت ثورة في دراسة وظيفة الخلايا المناعية طن فيفو 6،7. في حين أن هذه الدراسات تقدمت فهمنا للخلية T-ظائف في الجسم الحي، T-ACT خلية مقرها في التجارب السريرية يتطلب الحاجة إلى ربط الميزات الجزيئية والوظيفية للخلية T-الاستعدادات قبل التسريب مع الفعالية السريرية بعد التسريب، من خلال الاستفادة في المقايسات المختبر رصد الخلايا T-ظائف مثل إفراز خلوى السمسة و. وقد وضعت معيار التدفق الخلوي المقايسات تستند إلى تحديد الأداء العام للسكان من الخلايا T على مستوى وحيدة الخلية ولكن هذه ليست مناسبة لرصد وتشكيل المتقارن أعمار أو قدرة الخلية نفسها لقتل أهداف متعددة 8.
صفائف Microfabricated مصممة في مثل البوليمرات حيويا polydimethylsiloxane (PDMS) هي وسيلة جذابة بشكل خاص لحصر مكانيا المستجيبات والأهداف في حجم صغير 9. بالاشتراك مع المجهري مضان الآلي الوقت الفاصل بين، ثويمكن رصدها من usands المستجيب المستهدفة التفاعلات في وقت واحد من الآبار الفردية تصوير مجموعة nanowell. نقدم هنا منهجية عالية الإنتاجية لرصد الخلايا T-السمسة بوساطة على مستوى وحيدة الخلية التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسة وظائف الخلايا T لحل الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أوجزنا بروتوكول لفحص وحيدة الخلية الإنتاجية العالية عن طريق تمكين لحل الخلايا الحضانة المشتركة للالمستجيبات والأهداف في صفائف nanowells (الشكل 1). بالإضافة إلى الإنتاجية والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على رصد المستجيب بوساطة السمسة ضد الخلايا اله?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أفادت الأبحاث في هذا المنشور كان مدعوما من المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة القومية تحت رقم R01CA174385 جائزة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
Referências
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
