Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Summary

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Abstract

Inmunoterapia del cáncer puede aprovechar la especificidad de la respuesta inmune para atacar y eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) sobre la base de la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) ha mostrado una promesa considerable en los ensayos clínicos ^1-4. Hay varias ventajas de utilizar CAR ⁺ células T para el tratamiento de cánceres, incluyendo la capacidad de apuntar no-MHC antígenos restringidos y para funcionalizar las células T para la supervivencia óptima, mensajeras y persistencia dentro del huésped, y finalmente para inducir la apoptosis de CAR ⁺ células T en el caso de toxicidad para el huésped ^5.

La delineación de las funciones óptimas de CAR ⁺ células T asociados con un beneficio clínico es esencial para el diseño de la próxima generación de ensayos clínicos. Los recientes avances en imágenes de animales vivos como microscopía multifotónica han revolucionado el estudio de la función celular inmune in vivo ^6,7. Aunque estos estudios han avanzado nuestra comprensión de las funciones de las células T in vivo, las células T ACT basada en ensayos clínicos, requiere la necesidad de vincular las características moleculares y funcionales de las células T preparaciones de pre-infusión con eficacia clínica después de la infusión, utilizando pt ensayos in vitro de vigilancia de células T como las funciones, la citotoxicidad y la secreción de citoquinas. Estándar de citometría de flujo basados ​​en ensayos han sido desarrollados que determinan el funcionamiento general de las poblaciones de células T a nivel de una sola célula, pero estos no son adecuados para el seguimiento de la formación de conjugado y tiempos de vida o la capacidad de la misma célula para matar múltiples objetivos ^8.

Arrays microfabricados diseñado en polímeros biocompatibles, como el polidimetilsiloxano (PDMS) son un método particularmente atractivo para confinar espacialmente efectores y objetivos en volúmenes pequeños ^9. En combinación con la microscopía de fluorescencia automatizado time-lapse, aunqueusands de interacciones efector-objetivo pueden ser controlados simultáneamente por los distintos pozos de imágenes de una gran nanowell. Se presenta aquí una metodología de alto rendimiento para el seguimiento de la citotoxicidad de células T mediada a nivel de una sola célula que puede aplicarse ampliamente para estudiar la funcionalidad de las células T citolítica.

Protocol

1. Reactivos Preparación Preparar RPMI-PLGH mediante la mezcla de 500 ml ml de RPMI-1640 y 5 de cada uno de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, y la solución de HEPES. Preparar R10 solución mediante la mezcla de RPMI-PLGH con suero fetal bovino al 10% (FBS). El FBS es inactivado por calor a 56 ° C durante 30 min antes de la adición. Pre-caliente a 37 º C 50 ml de medio RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, y 15 de R10 en tubos cónicos estériles. Fabricación de matrices de nano…

Representative Results

Un ejemplo de la aplicación del ensayo citolítico de alto rendimiento se demuestra en la Figura 2. Brevemente, etiquetado específico CD19-CAR + células T se co-incubaron con células diana marcadas ratón EL4 en los pocillos individuales de una matriz de nanowell (Secciones 1-5). Una imagen inicial se registró en el microscopio fluorescente automatizada para identificar la ocupación (efectores y / o metas) de todos y cada uno nanowell en la matriz (Sección 6). El procesamiento de imág…

Discussion

Hemos esbozado el protocolo para un alto rendimiento de una sola célula ensayo citolítico habilitado a través de co-incubación de los efectores y metas en las matrices de nanowells (Figura 1). Además de rendimiento de una de las principales ventajas de la técnica es la capacidad de controlar efectora mediada por la citotoxicidad contra células diana deseadas sin la necesidad de la ingeniería de las células diana que a su vez permite el uso de células tumorales autólogas o apareadas / primaria…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell