Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Summary

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Abstract

L'immunothérapie du cancer permet d'exploiter la spécificité de la réponse immunitaire à cibler et à éliminer les tumeurs. Thérapie cellulaire adoptive (ACT) basé sur le transfert adoptif de lymphocytes T génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur d'antigène chimérique (CAR) a montré très prometteur dans les essais cliniques ^1-4. Il ya plusieurs avantages à utiliser CAR ⁺ lymphocytes T pour le traitement de cancers, y compris la capacité de cibler des antigènes du CMH non réglementées et pour fonctionnaliser les lymphocytes T pour la survie optimale, tête chercheuse et de la persistance dans l'hôte, et enfin à induire l'apoptose de CAR ⁺ Les cellules T dans le cas de ⁵ toxicité hôte.

La délimitation des fonctions optimales de CAR ⁺ lymphocytes T associés à un bénéfice clinique est essentielle pour concevoir la prochaine génération des essais cliniques. Les progrès récents de l'imagerie des animaux vivants comme la microscopie multiphotonique ont révolutionné l'étude de la fonction des cellules immunitaires in vivo ^6,7. Bien que ces études ont fait progresser notre compréhension des fonctions des cellules T in vivo, des cellules T ACT basée sur des essais cliniques nécessite la nécessité de relier les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des cellules T préparations pré-infusion avec une efficacité clinique après la perfusion, en utilisant pt tests in vitro des cellules T surveillance des fonctions telles que, la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines. Standard de cytométrie en flux ont été basés sur des tests élaborés pour déterminer le fonctionnement global des populations de cellules T au niveau d'une seule cellule, mais celles-ci ne sont pas appropriés pour le suivi et la formation de conjugués vie ou la capacité de la cellule même de tuer plusieurs cibles ^8.

Microfabriqués tableaux conçus dans des polymères biocompatibles tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) constituent une méthode particulièrement attrayante pour limiter l'espace effecteurs et des cibles dans de petits volumes ^9. En combinaison avec la microscopie à fluorescence automatisé time-lapse, quoiqueusands d'effecteur-cible interactions peuvent être surveillés simultanément par des puits individuels d'imagerie d'un tableau nanowell. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour la surveillance cytotoxicité à médiation cellulaire T-au niveau d'une seule cellule qui peut être largement appliquée à l'étude de la fonctionnalité des lymphocytes T cytolytiques.

Protocol

1. Préparation des réactifs Préparer un milieu RPMI-PLGH en mélangeant 500 ml du milieu RPMI-1640 et 5 ml de pénicilline-streptomycine, L-glutamine, l'HEPES et de la solution. Préparer R10 solution en mélangeant RPMI-PLGH avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). La FBS est inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min avant l'addition. Préchauffer à 37 ° C 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, et 15 de la R10 dans des tubes coniques stériles. Fabrication des …

Representative Results

Un exemple de l'application de l'analyse à haut débit cytolytique est démontré dans la figure 2. En bref, étiqueté CD19 spécifique CAR + cellules T ont été co-incubées avec des cellules de souris marqués cibles EL4 dans les puits individuels d'un tableau nanowell (articles 1-5). Une image initiale a été enregistré sur le microscope fluorescent automatisé pour identifier l'occupation (effecteurs et / ou cibles) de chaque nanowell unique sur le réseau (section 6)…

Discussion

Nous avons décrit le protocole pour un haut débit seule cellule d'essai cytolytique activé via la co-incubation des effecteurs et des cibles dans les tableaux de nanowells (figure 1). En plus de débit d'un avantage majeur de cette technique est la possibilité de surveiller effecteur cytotoxicité à médiation contre des cellules cibles désirées sans avoir besoin de l'ingénierie cellulaire cible qui à son tour permet l'utilisation de autologues ou appariés / primaire cellules t…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell