Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Summary

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Abstract

Immunoterapia cancro può sfruttare la specificità della risposta immunitaria per individuare e eliminare i tumori. Terapia cellulare adottiva (ACT) basato sul trasferimento adottivo di cellule T geneticamente modificate per esprimere un recettore chimerico antigene (CAR) ha mostrato promettente in studi clinici ^1-4. Ci sono molti vantaggi di utilizzare CAR ⁺ cellule T per il trattamento di tumori tra cui la possibilità di individuare antigeni ristrette non MHC e di funzionalizzare le cellule T per la sopravvivenza ottimale, homing e la persistenza all'interno dell'ospite e, infine, per indurre l'apoptosi delle CAR ⁺ cellule T in caso di tossicità ospitante ^5.

Delineare le funzioni ottimali di CAR ⁺ cellule T associate a beneficio clinico è essenziale per la progettazione della prossima generazione di studi clinici. I recenti progressi nella diagnostica per immagini di animali vivi, come la microscopia multifotone hanno rivoluzionato lo studio della funzione delle cellule immunitarie in vivo ^6,7. Mentre questi studi hanno avanzato la nostra comprensione di funzioni delle cellule T in vivo, cellule T ACT basata in studi clinici richiede la necessità di collegare le caratteristiche molecolari e funzionali di cellule T preparazioni pre-infusione con efficacia clinica post-infusione, utilizzando in vitro monitoraggio funzioni delle cellule T come, citotossicità e la secrezione di citochine. Standard di flusso-citometria saggi basati sono stati sviluppati che determinano il funzionamento complessivo di popolazioni di cellule T a livello di singola cellula, ma questi non sono adatti per il monitoraggio e la formazione coniugato vite o la capacità della cellula stessa per uccidere più bersagli ^8.

Array microfabbricati progettati in polimeri biocompatibili come polidimetilsilossano (PDMS) è un metodo particolarmente interessante per limitare spazialmente effettori e gli obiettivi in piccoli volumi ^9. In combinazione con automatico time-lapse microscopia a fluorescenza, thousands di effettore bersaglio interazioni può essere monitorato contemporaneamente da singoli pozzetti di imaging di una matrice di nanowell. Vi presentiamo qui un high-throughput metodologia per il monitoraggio delle cellule T citotossicità mediata a livello di singola cellula che può essere ampiamente applicata allo studio della funzionalità delle cellule T citolitica.

Protocol

1. Reagenti Preparazione Preparare RPMI-PLGH miscelando 500 ml ml RPMI-1640 e 5 ciascuno di penicillina-streptomicina, L-glutamina, e la soluzione di HEPES. Preparare R10 soluzione miscelando RPMI-PLGH con 10% siero fetale bovino (FBS). L'FBS è inattivati ​​termicamente a 56 ° C per 30 minuti prima dell'aggiunta. Pre-riscaldare a 37 ° C 50 ml di RPMI-PLGH, 15 ml ml di PBS, e 15 di R10 in sterili provette coniche. Fabbricazione di matrici di nanowells in PDMS: Il ma…

Representative Results

Un esempio di applicazione del saggio ad alta prestazione citolitica è mostrato nella Figura 2. In breve, l'etichetta-CD19 specifici CAR + cellule T sono state co-incubate con marcate topo EL4 cellule bersaglio nei singoli pozzetti di una matrice nanowell (sezioni 1-5). L'immagine iniziale è stata registrata sul microscopio a fluorescenza automatizzata per identificare l'occupazione (effettori e / o gli obiettivi) di ogni singolo nanowell sull'array (sezione 6). L'elabor…

Discussion

Abbiamo delineato il protocollo per un high-throughput cella singola saggio citolitica abilitato tramite co-incubazione di effettori e degli obiettivi in matrici di nanowells (Figura 1). Oltre a un throughput un grande vantaggio di questa tecnica è la capacità di monitorare effettore la citotossicità contro cellule bersaglio desiderate senza necessità di engineering cellule bersaglio che a sua volta consente l'uso di cellule tumorali autologhe o matched / primaria come cellule bersaglio. Il conf…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell