Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Summary

Vi beskriver en enkelt-celle high-throughput assay til måling af cytotoksicitet af T-celler, når inkuberet med tumormålceller. Denne fremgangsmåde anvender en tæt, elastomere matrix af sub-nanoliter brønde (~ 100.000 brønde / række) til rumligt begrænse de T-celler og målceller ved definerede forhold og er koblet til fluorescensmikroskopi for at overvåge effektor-mål-konjugation og efterfølgende apoptose.

Abstract

Kræft immunterapi kan udnytte specificiteten af ​​immunrespons til at målrette og fjerne tumorer. Adoptiv celleterapi (ACT) baseret på den adoptive overførsel af T-celler genmodificerede til at udtrykke et kimært antigen receptor (CAR) har vist betydelig lovende i kliniske forsøg ^1-4. Der er flere fordele ved at bruge CAR ⁺ T-celler til behandling af cancere, herunder evnen til at målrette ikke-MHC-begrænsede antigener og at funktionalisere T-cellerne for optimal overlevelse, homing og vedholdenhed i værten, og endelig at inducere apoptose af CAR ⁺ T-celler i tilfælde af værtsorganismens toksicitet ^5.

Afgrænse de optimale funktioner CAR ⁺ T-celler, der er forbundet med klinisk fordel er afgørende for tilrettelæggelsen af den næste generation af kliniske forsøg. Nylige fremskridt inden for levende dyr billedbehandling som multiphoton mikroskopi har revolutioneret studiet af immun celle funktion in vivo ^6,7. Mens disse studier har fremmet vores forståelse af T-cellefunktioner in vivo, T-celle-baserede ACT i kliniske forsøg kræver, at det er nødvendigt at forbinde molekylære og funktionelle egenskaber af T-cellepræparater præ-infusion med klinisk effektivitet efter infusion, ved anvendelse i vitro assays overvågning T-cellefunktioner lignende, cytotoksicitet og cytokinsekretion. Standard flow-cytometri assays er blevet udviklet, at bestemme den overordnede funktion af populationer af T-celler på enkeltcelle-niveau, men disse er ikke egnet til overvågning af konjugatdannelse og levetid eller mulighed for den samme celle at dræbe flere mål ^8.

Microfabricated arrays designet i biokompatible polymerer, såsom polydimethylsiloxan (PDMS) er en særdeles attraktiv metode til rumligt begrænse effektorer og mål i små volumener ^9. I kombination med automatiseret time-lapse fluorescensmikroskopi, thousands af effektor-mål-interaktioner kan overvåges samtidigt af billeddannende individuelle brønde i en nanowell array. Vi præsenterer her en high-throughput metode til overvågning af T-cellemedieret cytotoksicitet på enkeltcelle-niveau, der stort set anvendes til at studere den cytolytiske funktion af T-celler.

Protocol

1. Reagenser Forberedelse Forbered RPMI-PLGH ved at blande 500 ml RPMI-1640 og 5 ml hver af penicillin-streptomycin, L-glutamin og HEPES opløsning. Forbered R10 opløsning ved at blande RPMI-PLGH med 10% føtalt bovint serum (FBS). The FBS er varmeinaktiveret ved 56 ° C i 30 min før tilsætning. Pre-varme ved 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS, og 15 ml R10 i sterile koniske rør. Fremstilling af arrays af nanowells i PDMS: The silicium master er fremstillet ved hjælp af foto…

Representative Results

Et eksempel på anvendelsen af high-throughput cytolytisk assay er vist i figur 2. Kort fortalt mærket CD19-specifik CAR + T-celler blev co-inkuberet med mærkede muse-EL4-målceller i de enkelte brønde i en nanowell matrix (afsnit 1-5). Et første billede blev optaget på den automatiserede fluorescerende mikroskop for at identificere belægning (effektorer og / eller mål) af hver enkelt nanowell på array (afsnit 6). Billedbehandling blev anvendt til at identificere alle nanowells indeho…

Discussion

Vi har skitseret protokollen for en high-throughput encellede cytolytisk assay aktiveret via co-inkubation af effektorer og mål i arrays af nanowells (figur 1). Ud over gennemløb en væsentlig fordel ved teknikken er evnen til at overvåge effektor-medieret cytotoksicitet mod ønskede målceller uden behov for målcellen teknik som igen tillader anvendelse af autologe eller matched / primære tumorceller som målceller. Den rumlige indeslutning tillader hentning og efterfølgende kloning af funktionel…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell