Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Summary

Vi beskriver en encellet high-throughput analysen å måle cytotoksisitet av T-celler når inkubert med tumor målceller. Denne fremgangsmåten anvender en tett, elastomeriske rekke sub-nanoliter brønner (~ 100.000 brønner / array) til romlig begrense den T-celler og målceller ved definerte forholdstall og er koblet til fluorescens mikroskopi å overvåke effektor-target konjugering og påfølgende apoptose.

Abstract

Kreft immunterapi kan utnytte det spesielle ved immunresponsen å målrette og eliminere svulster. Adoptive celleterapi (ACT) basert på den adoptive overføring av T-celler genetisk modifisert til å uttrykke et kimert antigen reseptoren (CAR) har vist betydelige løftet i kliniske studier ^1-4. Det er flere fordeler ved å bruke CAR ⁺ T celler for behandling av kreftformer inkludert muligheten til å målrette mot MHC bundne antigener og å functionalize T-cellene for optimal overlevelse, homing og utholdenhet i verten, og endelig til å indusere apoptose av CAR ⁺ T-celler i tilfelle verten toksisitet ^5.

Opptegning av optimale funksjoner CAR ⁺ T celler forbundet med klinisk effekt er avgjørende for utformingen av neste generasjon av kliniske studier. Nylige fremskritt i levende dyr avbildning som multiphoton mikroskopi har revolusjonert studiet av immunceller funksjon in vivo ^6,7. Mens disse studiene har utvidet vår forståelse av T-celle funksjoner i vivo, T-celle basert ACT i kliniske studier krever behovet for å knytte molekylære og funksjonelle trekk ved T-celle preparater forinnsprøytning med klinisk effekt etter infusjon, ved å utnytte i vitro overvåking T-celle funksjoner som, cytotoksisitet og cytokin sekresjon. Standard flow-cytometri baserte analyser har blitt utviklet som bestemmer den totale funksjon av populasjoner av T-celler på enkelt-celle-nivå, men disse er ikke egnet til å overvåke konjugat formasjon og levetid eller evnen av den samme cellen å drepe flere mål ^8.

Microfabricated matriser designet i biokompatible polymerer som polydimetylsiloksan (PDMS) er en spesielt attraktiv metode for å romlig begrense effektorer og mål i små volumer ^9. I kombinasjon med automatisk time-lapse fluorescens mikroskopi, thousands av effektor-target interaksjoner kan overvåkes samtidig av bildebehandling individuelle brønner på et nanowell array. Vi presenterer her en high-throughput metoden for overvåking T-cellemediert cytotoksisitet på enkelt-celle-nivå som kan bredt anvendt til å studere cytolytisk funksjonaliteten av T-celler.

Protocol

1. Reagenser Forberedelse Forbered RPMI-PLGH ved blanding 500 ml RPMI-1640 og 5 ml hver av Penicillin-streptomycin, L-glutamin, og HEPES-løsning. Forbered R10 løsning ved å blande RPMI-PLGH med 10% fetalt bovint serum (FBS). FBS er varme-inaktivert ved 56 ° C i 30 min før tilsetning. Forvarme ved 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS, og 15 ml R10 i sterile koniske rør. Fabrikasjon av matriser av nanowells i PDMS: Silisium Master er fremstilt ved hjelp av fotolitografi hovedsa…

Representative Results

Et eksempel på anvendelsen av high-throughput cytolytisk analysen er vist i figur 2. Kort, merket CD19-spesifikke CAR + T-celler ble ko-inkubert med merkede mus EL4 målceller i de individuelle brønnene til en nanowell matrise (§ § 1-5). En innledende bildet ble tatt på den automatiserte fluorescerende mikroskop for å identifisere belegg (effektorer og / eller mål) av hvert enkelt nanowell på tabellen (§ 6). Bildebehandling ble brukt til å identifisere alle nanowells inneholder nøy…

Discussion

Vi har skissert protokollen for en high-throughput encellede cytolytisk analysen aktivert via co-inkubering av effektorer og mål i matriser av nanowells (figur 1). I tillegg til gjennomstrømming en stor fordel av teknikken er evnen til å overvåke effektor-mediert cytotoksisitet mot ønskede målceller uten behov for målcellen Engineering som i sin tur tillater bruk av autologe eller matchet / primær tumor celler som målceller. Den romlige innesperring tillater innhenting og påfølgende kloning a…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell