Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Summary

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Abstract

Imunoterapia do cancro pode aproveitar a especificidade da resposta imunitária para alvejar e eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) com base na transferência adoptiva de células T geneticamente modificadas para expressar um receptor de antigénio quimérico (CAR) se mostrou promissora em ensaios clínicos ^1-4. Existem várias vantagens de usar CAR ⁺ células T para o tratamento de cancros, incluindo a capacidade para alvejar os antigénios do MHC não-limitados e para funcionalizar as células T para a sobrevivência óptima, homing e persistência no interior do hospedeiro, e, finalmente, para induzir a apoptose de CAR ⁺ As células T, em caso de toxicidade central ^5.

Delineando as funções ideais de CAR ⁺ células T associados com o benefício clínico é essencial para projetar a próxima geração de ensaios clínicos. Os recentes avanços na imagem animal vivo como microscopia multifotônica revolucionaram o estudo da função de células imunes in vivo ^6,7. Embora estes estudos tenham avançado a nossa compreensão da função das células T in vivo, de células T ACT baseada em ensaios clínicos exige a necessidade de ligar as características moleculares e funcionais de células T preparações pré-infusão com eficácia clínica pós-perfusão, utilizando-se, em Os ensaios in vitro de células T de monitorização funções como, citotoxicidade e a secreção de citocinas. Padrão de citometria de fluxo-ensaios baseados foram desenvolvidos para determinar o funcionamento geral das populações de células T ao nível de uma única célula, mas estes não são adequados para a monitorização e a formação de conjugado vidas ou a capacidade da mesma célula para matar alvos múltiplos ^8.

Matrizes microfabricated projetados em polímeros biocompatíveis como polidimetilsiloxano (PDMS) é um método particularmente atraente para confinar espacialmente efetores e metas em pequenos volumes ^9. Em combinação com a microscopia de fluorescência automatizado lapso de tempo, thousands de-alvo efetor interações podem ser monitoradas simultaneamente por poços individuais de imagem de uma matriz nanowell. Apresentamos aqui um método de alto rendimento para a monitorização de células T da citotoxicidade mediada ao nível de uma única célula que pode ser amplamente aplicado para estudar a função de células T citolíticas.

Protocol

1. Preparação de reagentes Prepare RPMI-PLGH misturando 500 ml ml de RPMI-1640 e 5 de cada um de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, HEPES e solução. Prepare R10 solução misturando RPMI-PLGH com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). O FBS inactivado pelo calor é a 56 ° C durante 30 min antes da adição. Pré-aquecido a 37 ° C de 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, e 15 de R10 em tubos cónicos estéreis. Fabricação de matrizes de nanowells em PDMS: O mestre de silício…

Representative Results

Um exemplo da aplicação do ensaio de elevado débito citolítica é demonstrado na Figura 2. Resumidamente, CD19 marcado específico CAR + células T foram co-incubadas com células EL4 marcadas rato alvo nos poços individuais de uma matriz nanowell (secções 1-5). Uma imagem inicial foi gravado no microscópio fluorescente automatizada para identificar a ocupação (efectores e / ou alvos) de cada nanowell único na matriz (Secção 6). Processamento de imagem foi usada para identificar …

Discussion

Temos descrito o protocolo para um ensaio de elevado rendimento de célula única citolítica activado através de co-incubação de efectores e alvos em matrizes de nanowells (Figura 1). Além disso a taxa de transferência de uma grande vantagem da técnica é a capacidade de monitorizar efectora mediada por citotoxicidade contra células alvo desejadas, sem a necessidade para a engenharia de células alvo, que por sua vez permite o uso de autólogos ou matched / primário de células tumorais, como a…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell