Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Summary

Мы описываем одноклеточных высокой пропускной способностью анализа для оценки цитотоксичности Т-клеток при инкубации с опухолевыми клетками-мишенями. Этот метод используется плотная, эластомерных массив к югу от nanoliter скважин (~ 100000 скважин / массив) для пространственно ограничить Т-клетки и клетки-мишени в определенных соотношениях и соединен с флуоресцентной микроскопии для контроля эффекторных-целевого сопряжения и последующего апоптоза.

Abstract

Иммунотерапии рака могут использовать специфику иммунного ответа на цель и устранения опухоли. Приемные клеточная терапия (АКТ) на основе приемных передачи Т-клеток, генетически модифицированные, чтобы выразить химерный рецептор антигена (CAR) показали значительные перспективы в клинических испытаниях ^1-4. Есть несколько преимуществ использования CAR ⁺ Т-клеток для лечения рака, включая возможность направлять не-MHC антигенов и ограниченных к функционализации Т-клетки для оптимального выживания, самонаведения и настойчивость в принимающей, и, наконец, чтобы индуцировать апоптоз CAR ⁺ Т-клетки в случае хозяин токсичности ^5.

Разграничении оптимальной функции CAR ⁺ Т-клеток, связанных с клинические преимущества имеет важное значение для разработки следующего поколения клинических испытаний. Последние достижения в области изображений живых животных, как многофотонной микроскопии революцию в изучении функции иммунных клеток яп естественных ^6,7. Хотя эти исследования расширили наше понимание Т-клеточной функции в живом организме, Т-клеточной основе СПО в клинических испытаниях требует необходимость увязки молекулярные и функциональные особенности Т-клеточных препаратов предварительной инфузии с клинической эффективности после инфузии, с использованием в лабораторных анализов мониторинг Т-клеточной функции, такие как, цитотоксичности и секрецию цитокинов. Стандартный проточной цитометрии на основе анализа были разработаны, которые определяют общее функционирование популяций Т-клеток в одной клетке уровне, но они не пригодны для мониторинга формирования и сопряженных жизни или способности и той же клетке, чтобы убить несколько целей ^8.

Microfabricated массивов разработан в биосовместимые полимеры, такие как полидиметилсилоксана (PDMS) являются особенно привлекательным методом пространственно ограничить эффекторов и мишеней в небольших объемах ^9. В сочетании с автоматической покадровой флуоресцентной микроскопии, Тхоusands эффекторных-целевого взаимодействия могут быть проверены одновременно визуализации отдельных скважин из массива nanowell. Мы приведем здесь высокой пропускной методологии мониторинга Т-клеточной цитотоксичности на одной клеточном уровне, которые могут быть широко применены к изучению цитолитического функциональности Т-клеток.

Protocol

1. Подготовка реагентов Подготовка RPMI-PLGH путем смешивания 500 мл RPMI-1640 и 5 мл каждого из пенициллин-стрептомицина, L-глутамин, и решение HEPES. Подготовка R10 решение путем смешивания RPMI-PLGH с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). FBS является инактивированной нагреванием при 56 ° С в …

Representative Results

Примером применения высокой пропускной цитолитического анализа показано, на рисунке 2. Короче говоря, помечены CD19 конкретных CAR + Т-клетки инкубируют с меченым мыши EL4 клетки-мишени в отдельных скважинах массива nanowell (разделы 1-5). Исходное изображение было записано на авто…

Discussion

Мы наметили протокол для высокой пропускной способности одноклеточных цитолитического анализа включается с помощью совместной инкубации эффекторов и мишеней в массивах nanowells (рис. 1). В дополнение к пропускной Основным преимуществом метода является возможность контролирова…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell