Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali
Summary
Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l'analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.
Abstract
Interazioni fisiche tra i lipidi incorporati alfa-elica domini di proteine di membrana svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento e assemblaggio di complessi proteici di membrana e in processi dinamici quali transmembrana (TM) di segnalazione e regolazione della superficie cellulare proteina livelli. Comprendere le caratteristiche strutturali di guida l'associazione di particolari sequenze richiede sofisticate analisi biofisiche e biochimiche dei complessi peptide TM. Tuttavia, l'idrofobicità estrema domini TM rende molto difficile da manipolare utilizzando tecniche standard di chimica dei peptidi, e la produzione di materiale idoneo studio dimostra spesso proibitivo impegnativo. Identificare le condizioni in base alle quali i peptidi possono adottare conformazioni elicoidali stabili e formano complessi spontaneamente aggiunge un ulteriore livello di difficoltà. Presentiamo qui un procedimento per la produzione di omo-o etero-dimeri peptide TM da materiali che sono espressi in E. coli, consentendo incorporazione di etichette isotopi stabili per risonanza magnetica nucleare (NMR) o amminoacidi non naturali per altre applicazioni relativamente a buon mercato. L'innovazione principale di questo metodo è che i complessi TM vengono prodotti e purificato come covalentemente associate disolfuro (reticolato) gruppi che possono formare strutture stabili, e stechiometrica omogenea quando ricostituito in detergente, o altri lipidi di membrana-mimetici materiali. Presentiamo anche scrupolosamente alle procedure ottimizzate per l'espressione e la purificazione che sono ugualmente applicabili se la produzione di singoli domini TM o complessi reticolati e fornire consigli per adeguare tali metodi per nuove sequenze TM.
Introduction
Questo protocollo dettagli una procedura che abbiamo sviluppato per la produzione di complessi disolfuro-stabilizzate di transmembrana (TM) peptidi per studi strutturali mediante NMR soluzione. La procedura si avvale dell'espressione robusta offerta dal sistema ΔtrpLE1413 fusione (vedi sotto) e permette complessi peptide TM di composizione definita da generare utilizzando sofisticate tecniche di isotopi stabili-etichettatura per i moderni multi-dimensionali esperimenti NMR. Abbiamo utilizzato queste tecniche per determinare le strutture NMR più importanti che hanno rivelato nuove informazioni su come linfociti-attivazione immunoreceptors sono assemblati da più subunità delle proteine di membrana attraverso interazioni tra i loro domini TM (recentemente rivisto in 1). Queste tecniche sono applicabili a sistemi a membrana molte altre proteine così come una vasta gamma di metodi analitici valle oltre a NMR soluzione. Mentre l'esempio qui utilizza residui di cisteina nativiper creare un complesso che imita la naturale disolfuro-legato proteina, il design è adatto sia per la creazione di legami disolfuro ingegnerizzati per stabilizzare complessi che sono normalmente tenuti insieme da deboli, interazioni non covalenti quali omo-e etero-TM complessi dimerici di recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR)-familiari proteine 2-4 o eterodimeri αβ complessi integrine 5,6.
Sequenze peptidiche estremamente idrofobi come quelli derivati dal doppio strato lipidico-spanning porzioni di proteine TM sono soggetti estremamente difficile per studi biochimici e biofisici. Oltre ad essere molto difficile da manipolare utilizzando proteina standard e tecniche di chimica dei peptidi, sono spesso molto tossici per le cellule e sono quindi difficili da produrre ricombinante. Noi e gli altri 7,8 9-11 hanno avuto un significativo successo esprimere tali sequenze peptidiche difficili nei batteri come in-frame carbossi-terminalefusioni di una versione modificata della sequenza ΔtrpLE1413 derivata dalla E. coli operone trp 12. Il ~ 13 kDa polipeptide codificato da trpLE questa sequenza possono essere prodotti a livelli elevati sotto un promotore T7 ed è interamente localizzato corpi di inclusione in cui sono elusione problemi di tossicità e / o instabilità. Modifica della sequenza mediante aggiunta di un amino-terminale 9-istidina 13 e eliminazione dei residui interni metionina e cisteina dalla sequenza trpLE 14 ammessi trpLE-peptide fusioni essere purificati da ioni metallo cromatografia di affinità e digerito con bromuro di cianogeno (CNBr ) per rilasciare la sequenza peptidica desiderata. Abbiamo utilizzato con successo questo sistema per esprimere più di una dozzina di sequenze differenti come fusioni trpLE che rappresentano frammenti di proteine di membrana che contengono fino a quattro domini TM (7,8 e risultati non pubblicati, vedere anche la sezione DISCUSSIONE).
Ilinnovazione chiave in questo protocollo è l'identificazione delle condizioni in cui i non strutturati e molto poco solubile trpLE-TM fusioni possono essere efficacemente disolfuro reticolato nel contesto di un flusso di lavoro ottimizzato. Diversi aspetti di alto rendimento di espressione, la manipolazione e la purificazione dei prodotti peptidici sono stati accuratamente ottimizzati, e le raccomandazioni qui presentate sono ugualmente rilevanti per la produzione di non-disolfuro-reticolati (monomerico) TM prodotti peptidici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Espressione di trpLE-TM fusioni. Nella nostra esperienza, trpLE-TM fusioni sono scarsamente espresse in mezzo di coltura ricca a 37 ° C, e le condizioni di coltura qui descritti sono dimostrate efficaci per molte differenti sequenze contenenti 1-4 domini TM con rese variabili 50-150 mg / L di puro, fusione intatta. Codifica Fusions tre o quattro frammenti TM GPCR (umano CCR5 TM1-TM3 e TM4-TM7, rispettivamente) o un frammento di nucleo catalitico umana peptidasi peptide di segnale (quattro domini TM; vedi rif <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Health and Medical Research Council of Australia (sovvenzione di progetto NHMRC 1.011.352 di MEC e MJC, Independent Research Infrastructure Istituti Support Scheme [IRIISS] sovvenzione WEHI) e il Governo del Victoria (Veski Innovazione Fellowship per MEC; Victorian State Government Supporto Operativo Infrastrutture per WEHI). MEC è una Regina Elisabetta II del Fellow Research Council australiano. EFXB riconosce il sostegno del programma di borse di studio Norma Hilda Schuster presso l'Università di Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
Referências
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