Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais
Summary
Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.
Abstract
Interacções físicas entre os lípidos incorporados alfa-helicoidais domínios de proteínas da membrana desempenham um papel crucial na dobragem e montagem de complexos de proteínas de membrana e em processos dinâmicos, como transmembranar (TM) de sinalização e regulação dos níveis de proteína da superfície celular. Compreender as características estruturais de condução a associação de seqüências particulares requer sofisticadas análises biofísicos e bioquímicos de complexos peptídeo TM. No entanto, a hidrofobicidade extrema de domínios TM torna-os muito difíceis de manipular utilizando técnicas de química de péptidos e a produção de material de estudo adequado muitas vezes se torna proibitivamente desafiador. Identificando as condições sob as quais os péptidos podem adoptar conformações helicoidais estáveis e formam complexos espontaneamente acrescenta outro nível de dificuldade. Apresentamos aqui um processo para a produção de homo-ou hetero-dímeros de complexos de peptídeos de TM a partir de materiais que são expressas em E. coli, o que permite a incorporação de etiquetas de isótopos estáveis para a ressonância magnética nuclear (RMN), ou não naturais, ácidos aminados para outras aplicações de forma relativamente barata. A principal inovação neste método é que os complexos de TM são produzidos e purificados como covalentemente associadas (dissulfureto reticulado) montagens que podem formar estruturas estáveis, estequiométrica e homogéneo, quando reconstituído em lípido detergente, ou outros materiais de membrana-miméticos. Nós também apresentamos procedimentos cuidadosamente otimizados para expressão e purificação que são igualmente aplicáveis se produzir domínios únicos TM ou complexos reticulados e dar conselhos para adaptar estes métodos para novas seqüências TM.
Introduction
Este protocolo detalhes um procedimento que desenvolvemos para produzir complexos estabilizados por dissulfureto de transmembrana (TM) péptidos para estudos estruturais de RMN utilizando solução. O processo tira partido da expressão robusta proporcionada pelo sistema de fusão ΔtrpLE1413 (ver abaixo) e permite que os complexos de peptídeos de TM da composição definida para ser gerados usando técnicas sofisticadas de isótopos estáveis de rotulagem para as modernas experiências de RMN multidimensionais. Nós empregamos essas técnicas para determinar as estruturas de RMN, que revelou várias novas e importantes informações sobre como linfócitos activadores immunoreceptors são montados a partir de subunidades de proteínas de membrana múltiplas através de interacções entre os seus domínios TM (recentemente revisto em 1). Estas técnicas são aplicáveis a muitos outros sistemas de membrana de proteína, bem como uma grande variedade de métodos analíticos a jusante para além RMN solução. Enquanto o exemplo dado aqui utiliza resíduos de cisteína nativospara criar um complexo que imita o naturalmente ligado por dissulfureto da proteína, a concepção é igualmente adequado para a criação de pontes de dissulfureto para estabilizar complexos de engenharia que são normalmente mantidas juntas por mais fracas, de interacções não covalentes tais como homo-e hetero-dímeros de complexos TM receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) da família de proteínas ou complexos de 2-4 heterodiméricos αβ integrina 5,6.
Extremamente hidrofóbicos sequências de péptidos tais como os derivados a partir da bicamada lipídica que mede porções de proteínas TM são assuntos extremamente difíceis para estudos bioquímicos e biofísicos. Para além de ser muito difícil de manipular utilizando proteína padrão e técnicas de química de péptidos, são frequentemente muito tóxicos para as células e, portanto, são difíceis de produzir por via recombinante. Nós e outros 7,8 9-11 têm tido um sucesso significativo expressar tais sequências peptídicas difíceis em bactérias tal como no quadro-carboxi-terminalfusões com uma versão modificada da sequência ΔtrpLE1413 derivado da E. coli operão trp 12. O polipéptido ~ 13 kDa trpLE codificada por esta sequência pode ser produzido em níveis elevados no âmbito de um promotor T7 e é totalmente localizado para corpos de inclusão em que os problemas relacionados com a toxicidade e / ou de instabilidade são contornadas. Modificação da sequência, por adição de um ácido amino-terminal 9 de histidina-tag 13 e eliminação de resíduos internos de metionina e cisteína da sequência de 14 trpLE permitidos trpLE peptídicos fusões de ser purificadas por cromatografia de afinidade de metal-ião e digerido com brometo de cianogénio (CNBr ) para libertar a sequência peptídica desejada. Temos utilizado com sucesso este sistema para expressar mais de uma dúzia de diferentes seqüências como fusões trpLE representam fragmentos de proteínas de membrana que contêm até quatro domínios TM (7,8 e resultados inéditos, ver também seção de discussão).
Oinovação chave neste protocolo é a identificação das condições em que os não estruturados e muito pouco solúvel trpLE-TM fusões podem ser eficientemente dissulfureto reticulado no contexto de um fluxo de trabalho simplificado. Vários aspectos da expressão de elevado rendimento, manipulação e purificação de produtos peptídicos foram também cuidadosamente optimizadas, e as recomendações aqui apresentadas são igualmente relevantes para a produção de não-reticuladas de dissulfureto (monomérico) Produtos TM peptídicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A expressão de fusões trpLE-TM. Na nossa experiência, trpLE-TM fusões são pobremente expressa em meio de cultura rico, a 37 ° C, e as condições de cultura aqui descritas tenham sido bem sucedida para muitas sequências diferentes contendo 1-4 domínios TM com rendimentos variando 50-150 mg / L de fusão pura e intacta. Codificação de fusões de três ou de quatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 e TM4-TM7, respectivamente) ou um fragmento do núcleo catalítico da peptidase sinal peptídeo h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para esta obra é fornecida pelo National Health and Medical Research Council da Austrália (NHMRC projeto de subsídio para 1.011.352 MEC e MJC; institutos de pesquisa independentes Regime de Apoio Infra-estrutura [IRIISS] subvenção para WEHI) e do Governo de Victoria (VESKI Inovação Fellowship ao MEC; vitoriana do Governo do Estado de Infra-estrutura de Apoio Operacional à WEHI). MEC é uma rainha Elizabeth II Fellow do Conselho de Pesquisa Australiano. EFXB reconhece o apoio do Programa de Bolsas de Norma Hilda Schuster, da Universidade de Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
Referências
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