Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований
Summary
Биофизические и биохимические исследования взаимодействий между мембраной вложенных областей белка сталкиваются со многими техническими проблемами, первым из которых является получение соответствующего учебного материала. В этой статье описывается протокол для получения и очистки дисульфида стабилизированного трансмембранного пептидных комплексов, которые подходят для структурного анализа по решению ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и других аналитических приложений.
Abstract
Физическое взаимодействие между липидов встроенным альфа-спиральных областей мембранные белки играют важную роль в сворачивании и монтаж комплексов мембранных белков и в динамических процессов, таких как трансмембранный (ТМ) сигнализации и регуляции клеточной поверхности белка. Понимание особенностей вождения ассоциации определенных последовательностей требует сложных биофизических и биохимических анализов комплексов ТМ пептидов. Тем не менее, крайние гидрофобность TM области делает их очень трудно манипулировать, используя стандартные методики химии пептидов, и производство из подходящего материала исследования часто оказывается чрезмерно сложной. Определение условий, при которых пептиды могут принять стабильный винтовой конформации и образуют комплексы спонтанно добавляет дополнительный уровень сложности. Здесь мы приводим процедуру для получения гомо-или гетеро-димерных TM пептидные комплексы из материалов, которые выражаются в E. седлоЯ, таким образом позволяя включения стабильных изотопов этикетки для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или не природные аминокислоты для других приложений относительно недорого. Основным новшеством в этом методе является то, что ТМ комплексы производят и очищают, как ковалентно связаны (дисульфид-сшитого) сборки, которые могут образовывать стабильные, стехиометрические и однородной структуры при восстановлении в моющие средства, липидов или других мембран-миметического материалов. Мы также представляем тщательно оптимизированы процедуры для экспрессии и очистки, что в равной степени применимы ли производство единичных доменов TM или сшитые комплексы и предоставлять рекомендации для адаптации этих методов к новым последовательностям TM.
Introduction
Этот протокол подробности процедуры мы разработали для получения дисульфида стабилизировалась комплексов трансмембранных (ТМ) пептиды для структурных исследований с использованием решения ЯМР. Процедура использует надежные выражения предоставляемой ΔtrpLE1413 слияние системы (см. ниже) и позволяет TM пептидных комплексов определенного состава, которые будут созданы с использованием сложных стабильных изотопных методов маркировки для современного многомерного ЯМР экспериментов. Мы использовали эти методы, чтобы определить несколько структур ЯМР, который показал новую важную информацию о том, как лимфоцит-активирующих immunoreceptors собираются из нескольких субъединиц мембранного белка через взаимодействие среди своих TM области (недавно рассмотрели в 1). Эти методы применимы ко многим другим мембранным белком систем, а также широкий спектр вниз по течению аналитических методов в дополнение к решению ЯМР. Хотя пример, приведенный здесь используется родной остатков цистеинасоздать комплекс, который имитирует естественно дисульфидными связями белка, дизайн одинаково хорошо подходит для создания инженерных дисульфидные связи для стабилизации комплексов, которые обычно удерживаются вместе слабыми, нековалентных взаимодействий, таких как гомо-и гетеро-TM димерных комплексов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR)-белков семейства 2-4 или гетеродимерные αβ интегрина комплексы 5,6.
Чрезвычайно гидрофобных пептидных последовательностей, таких как полученные из липидного бислоя, охватывающий часть белков TM чрезвычайно трудных предметов для биохимических и биофизических исследований. Кроме того, что очень сложно манипулировать с использованием стандартных белков и методы химии пептидов, они часто весьма токсичны для клеток и, следовательно, трудно производить рекомбинантно. Мы 7,8 и др. 9-11 имели значительный успех выражения таких сложных пептидных последовательностей у бактерий, как в рамке карбоксиконцевойслияния с модифицированной версией ΔtrpLE1413 последовательность, полученную из E. оперона кишечной ГТО 12. ~ 13 кДа trpLE полипептида, кодируемого этой последовательности могут быть произведены на высоком уровне под промотором Т7 и полностью локализованы тельца включения, где проблемы, связанные с токсичностью и / или нестабильности обойти. Модификация последовательности путем добавления аминоконцевой 9-гистидин тегов 13 и устранения внутренних метионина и цистеина из trpLE последовательности позволило trpLE 14-пептид слияния должна быть очищена от иона металла аффинной хроматографии и переваривается использованием цианогенбромидом (CNBr ), чтобы освободить желаемого пептидной последовательности. Мы успешно использовали эту систему, чтобы выразить более десятка различных последовательностей, как trpLE слияния представляют мембранные белки, которые содержат фрагменты целых четыре TM областях (7,8 и неопубликованные результаты, см. также раздел обсуждения).
Основным новшеством в этом протоколе является определение условий, при которых неструктурированные и очень плохо растворимы trpLE-TM слияния может быть эффективно дисульфида сшитые в контексте рационализации процессов. Некоторые аспекты высокодоходные выражения, обработки и очистки пептидов продукты также были тщательно оптимизированы, и рекомендации, представленные здесь, являются одинаково актуальными для производства не-дисульфид-сшитого (мономерные) продукции ТМ пептидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выражение trpLE-TM слияния. По нашему опыту, trpLE-TM слияния слабо выражены в богатой питательной среде при температуре 37 ° C, и культура условиях, описанных здесь оказались успешными для различных последовательностей, содержащих от одного до четырех TM областях с выходами в пределах от 50 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этой работы осуществляется национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (NHMRC проекта грант в 1011352 MEC и MJC, независимыми исследовательскими институтами инфраструктуры поддержки схеме [IRIISS] грант WEHI) и правительство штата Виктория (ВЕСКИ инноваций стипендий для MEC; Викторианская государственного управления операционной инфраструктуры поддержки WEHI). MEC является королева Елизавета II членом Австралийского исследовательского совета. EFXB признает поддержку со стороны Norma Хильда Шустер стипендиальной программы в Университете Мельбурна.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
Referências
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer–monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Bioquímica. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer’s amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
