La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales
Summary
Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.
Abstract
Interacciones físicas entre las incrustados lípido-alfa-helicoidales dominios de proteínas de membrana juegan un papel crucial en el plegamiento y ensamblaje de los complejos de proteínas de membrana y en procesos dinámicos tales como transmembrana (TM) de señalización y regulación de los niveles de proteína de la superficie celular. Descripción de las características estructurales que impulsan la asociación de secuencias particulares requiere sofisticados análisis biofísicos y bioquímicos de los complejos de péptido de TM. Sin embargo, la hidrofobia extrema de dominios TM hace que sean muy difíciles de manipular utilizando técnicas estándar de la química de péptidos, y la producción de material de estudio adecuado a menudo resulta prohibitivamente difícil. La identificación de condiciones bajo las cuales los péptidos pueden adoptar conformaciones helicoidales estables y complejos se forman espontáneamente añade un nivel más de dificultad. Aquí presentamos un procedimiento para la producción de homo-o hetero-dímeros complejos de péptido de TM a partir de materiales que se expresan en E. columnai, permitiendo así la incorporación de etiquetas de isótopos estables para resonancia magnética nuclear (RMN) o no naturales de aminoácidos para otras aplicaciones relativamente económica. La innovación clave de este método es que los complejos de TM son producidos y purificados como covalentemente asociados (disulfuro de reticulado) ensamblados que pueden formar estructuras estables, estequiométrica y homogénea, cuando se reconstituye en detergente, lípidos u otros materiales miméticos de membrana. También presentamos los procedimientos cuidadosamente optimizados para la expresión y purificación que son igualmente aplicables ya sea para producir un solo TM dominios o complejos entrecruzados y proporcionar asesoramiento para adaptar estos métodos a las nuevas secuencias de TM.
Introduction
Este protocolo detalla un procedimiento que hemos desarrollado para producir complejos estabilizados con disulfuro de péptidos transmembrana (TM) para los estudios estructurales mediante RMN solución. El procedimiento tiene la ventaja de la expresión robusta que ofrece el sistema de fusión ΔtrpLE1413 (ver más abajo) y permite que los complejos de péptidos de TM composición definida para ser generados usando sofisticadas técnicas de isótopos estables de etiquetado para los modernos experimentos de RMN multidimensionales. Hemos empleado estas técnicas para determinar varias estructuras de RMN que revelaron nueva información importante sobre cómo linfocitos activadores de immunoreceptors se ensambla a partir de múltiples subunidades de proteínas de membrana a través de interacciones entre sus dominios TM (recientemente revisado en 1). Estas técnicas son aplicables a muchos otros sistemas de proteínas de membrana, así como una amplia gama de métodos de análisis aguas abajo, además de RMN solución. Mientras que el ejemplo dado aquí utiliza residuos de cisteína nativospara crear un complejo que imita la forma natural unido por puentes disulfuro de proteínas, el diseño es igualmente adecuado para la creación de enlaces disulfuro de ingeniería para estabilizar complejos que normalmente se mantienen juntas por más débiles, interacciones no covalentes, tales como homo-y hetero-dímeros de complejos TM receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR)-proteínas de la familia 2-4 o αβ heterodimeric complejos integrina 5,6.
Extremadamente hidrófobos secuencias de péptidos tales como los derivados de la bicapa lipídica que abarca porciones de proteínas TM son sujetos excesivamente difícil para los estudios bioquímicos y biofísicos. Además de ser muy difícil de manipular usando proteína estándar y técnicas de química de péptidos, a menudo son muy tóxicos para las células y son por lo tanto difíciles de producir recombinantemente. Nosotros y otros 7,8 9-11 han tenido un éxito significativo expresar esas secuencias de péptidos difíciles en bacterias como en marco carboxi-terminalfusiones con una versión modificada de la secuencia ΔtrpLE1413 derivado de la E. coli trp operón 12. El polipéptido de ~ 13 kDa trpLE codificada por esta secuencia se puede producir en niveles elevados en virtud de un promotor T7 y está totalmente localizada en los cuerpos de inclusión donde los problemas relacionados con la toxicidad y / o la inestabilidad son eludidas. Modificación de la secuencia de la adición de un amino-terminal 9-histidina 13 y la eliminación de los residuos internos de metionina y cisteína de la secuencia trpLE 14 permitidos trpLE-péptido fusiones de ser purificada por metal-ion cromatografía de afinidad y digerido usando bromuro de cianógeno (CNBr ) para liberar la secuencia peptídica deseada. Hemos utilizado con éxito este sistema para expresar más de una docena de diferentes secuencias como fusiones TrpLE que representan fragmentos de proteínas de membrana que contienen hasta cuatro dominios TM (7,8 y resultados no publicados, véase también el apartado de discusión).
Lainnovación clave en este protocolo es la identificación de las condiciones en las que los no estructurados y muy poco soluble en trpLE-TM fusiones pueden ser eficientemente disulfuro de reticulado en el contexto de un flujo de trabajo optimizado. Varios aspectos de alto rendimiento de expresión, la manipulación y la purificación de los productos peptídicos también se han optimizado a fondo, y las recomendaciones que aquí se presentan son igualmente relevantes para la producción de no reticulados disulfuro productos (monomérica) TM peptídicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Expresión de trpLE-TM fusiones. En nuestra experiencia, trpLE-TM fusiones se expresó mal en medio de cultivo rico a 37 ° C, y las condiciones de cultivo descritas aquí han demostrado tener éxito para muchas secuencias diferentes que contienen de uno a cuatro dominios TM con rendimientos que oscilan 50 a 150 mg / L de fusión puro, intacto. Codificación de fusiones de tres o cuatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 y TM4 TM7-, respectivamente) o un fragmento de núcleo catalítico de la peptidasa …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación de este trabajo es proporcionada por el Sistema Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (NHMRC subvención del proyecto 1011352 al MEC y MJC, Institutos de Investigación Independiente Plan de Apoyo a la Infraestructura [IRIISS] subvención a WEHI) y el Gobierno de Victoria (Veski Innovación Becas MEC a; Apoyo del Gobierno del Estado de Victoria Operacional Infraestructura para WEHI). MEC es una reina Elizabeth II Fellow del Consejo de Investigación Australiano. EFXB reconoce el apoyo del Programa de Becas Norma Hilda Schuster de la Universidad de Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
Referências
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