ميكروفلويديك تصنيع المعالج وطريقة للكشف عن الأنفلونزا
Summary
وقد تم تطوير رقاقة متكاملة بالحرارة ميكروفلويديك لاستخدامها بوصفها التشخيص الجزيئي. رقاقة يؤدي استخلاص الحمض النووي، الناسخ العكسي، وPCR. يتم وصف طرق لانتاج وتشغيل الشريحة.
Abstract
التشخيص السريع والفعال يلعب دورا هاما في السيطرة على الأمراض المعدية من خلال تمكين الإدارة الفعالة للمريض والعلاج. هنا، نقدم متكاملة رقاقة ميكروفلويديك بالحرارة مع القدرة على تضخيم الأنفلونزا الناجمة عن الفيروس في مسحات المريض (NP) والبلعوم aspirates. عند تحميل عينة المريض، الجهاز ميكروفلويديك يحمل بالتسلسل من على الرقاقة تحلل الخلايا وتنقية RNA والخطوات تركيز في المرحلة الصلبة استخراج (SPE)، النسخ العكسي (RT) وتفاعل البلمرة سلسلة (PCR) في RT-PCR الدوائر، على التوالي. يتم تنفيذ نقطة النهاية الكشف باستخدام Bioanalyzer خارج رقاقة (اجيلنت تكنولوجيز، سانتا كلارا، كاليفورنيا). للأجهزة الطرفية، استخدمنا مضخة محقنة واحدة لدفع كاشف والعينات، في حين تم استخدام جهازي سخانات رقيقة مثل مصادر الحرارة لRT PCR والغرف. تم تصميم رقاقة لتكون طبقة واحدة ومناسبة لتصنيع إنتاجية عالية للحد من fabricatiفي الوقت المحدد والتكلفة. رقاقة ميكروفلويديك توفر منصة لتحليل طائفة واسعة من الفيروسات والبكتيريا، وقلة فقط من التغييرات في التصميم كاشف اللازمة لكشف مسببات الأمراض جديد لسعر الفائدة.
Introduction
تم الإبلاغ عن حالة وفاة الملايين من خلال أوبئة الأنفلونزا ثلاثة من القرن 20th 1. وعلاوة على ذلك، أعلن وباء أنفلونزا أحدث من منظمة الصحة العالمية (WHO) 2 في عام 2009، واعتبارا من أغسطس 1، 2010، 18449 حالة وفاة تم الإبلاغ من قبل منظمة الصحة العالمية 3. أظهرت هذا الوباء مرة أخرى عبء ارتفاع الأمراض المعدية، والحاجة إلى الكشف السريع والدقيق للأنفلونزا لتمكين سريع تأكيد المرض، حسب استجابة الصحة العامة والعلاج الفعال 4.
هناك العديد من الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتشخيص الأنفلونزا، وتشمل هذه المناعية السريع، اختبار مستضد مباشرة الفلورسنت (DFA) وأساليب الثقافة الفيروسية. المناعية السريع تفتقر بشكل كبير حساسية 5-8، في حين أن الآخر طريقتين هي كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا 9. الاختبارات الجزيئية توفر مزايا متعددة بما في ذلك دورانها قصيرة sensit، الأوانivity، وأعلى نوعية. وقد تم العديد من الكيانات التجارية تعمل من أجل الاختبارات الجزيئية بسرعة (وتسمى أيضا اختبارات الحامض النووي أو ناتس) للأمراض المعدية، ويكون عدة فحوصات الانفلونزا في خطوط الأنابيب الخاصة بهم. لكن معظمها تتطلب خارج رقاقة إعداد العينات. أي من التعديلات مختبر تحسن سريري (CLIA) تنازلت الاختبارات الجزيئية دمج إعداد العينات في خرطوشة الفحص أو وحدة نمطية.
المختبر على واحد في رقاقة التكنولوجيا تلعب دورا هاما في تطوير أجهزة اختبار نقطة من الرعاية. بعد إدخال شريحة PCR الأولى في 1993 10، وقد وضعت العديد من الجهود في تطوير رقائق النووي اختبار الحمض. ومع ذلك، سوى عدد قليل من هذه دمجت إعداد العينات الخام مع التضخيم المصب.
لقد أثبتنا سابقا التصغير من عمود مرحلة استخراج الصلبة (SPE) في رقاقة ميكروفلويديك البلاستيك 11 و تطويرمنة وتعظيم الاستفادة من شريحة تدفق مستمر PCR 12. هنا، ونحن تمديد العمل السابق لدمج SPE مع RT PCR والخطوات في شريحة واحدة لإثبات التشخيص السريري وقدرتها على تضخيم الأحماض النووية من مريض مسحات (NP) والبلعوم aspirates.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدم طريقة التشخيص هنا أثبتت قدرة على شريحة متكاملة من البلاستيك ميكروفلويديك لتضخيم أنفلونزا A RNA من عينات المرضى مع خصوصية عالية وحد اكتشاف أدنى مستوى في 13 قمنا بتصميم هذه الشريحة لنقطة المحتملة للتجارب الرعاية: (أ) درجة الحرارة وfluidic تم تبسيط السيطرة، (ب) هو رق?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Referências
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
