Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l'influenza
Summary
Integrato chip microfluidica termoplastico è stato sviluppato per l'utilizzo come diagnostica molecolare. Il chip esegue l'estrazione di acido nucleico, la trascrittasi inversa e PCR. Metodi per la fabbricazione e l'esecuzione del chip sono descritti.
Abstract
Diagnostica rapida ed efficace svolgono un ruolo importante nel controllo delle malattie infettive, consentendo la gestione efficace del paziente e del trattamento. Qui, presentiamo integrato chip microfluidica termoplastico con la capacità di amplificare virus in pazienti nasofaringei (NP) tamponi e aspirati. Una volta caricato il campione del paziente, il dispositivo microfluidico esegue sequenzialmente su-chip lisi cellulare, purificazione dell'RNA e concentrazione all'interno estrazione in fase solida (SPE), la trascrizione inversa (RT) e la reazione a catena della polimerasi (PCR) in RT-PCR camere, rispettivamente. End-point di rilevamento è effettuato con un off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Per le periferiche, abbiamo utilizzato una sola pompa siringa per guidare reagenti e campioni, mentre due riscaldatori a pellicola sottile sono stati utilizzati come sorgenti di calore per la PCR e RT camere. Il chip è progettato per essere a singolo strato e adatta per la produzione ad alto throughput per ridurre il fabricatiil tempo e il costo. Il chip microfluidico fornisce una piattaforma per analizzare una varietà di virus e batteri, limitato solo dalle variazioni di progettazione reagenti necessari per individuare nuovi agenti patogeni di interesse.
Introduction
Milioni di morti sono stati segnalati nel corso delle tre pandemie influenzali del 20 ° secolo 1. Inoltre, la pandemia influenzale più recente è stato dichiarato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) 2 nel 2009, e dal 1 ° agosto 2010, 18.449 decessi sono stati segnalati dall'OMS 3. Questa pandemia dimostrato ancora una volta l'elevato onere delle malattie infettive, e la necessità di una rapida ed accurata di influenza per la conferma rapida della malattia, la risposta del caso la salute pubblica e un trattamento efficace 4.
Ci sono diversi metodi ampiamente utilizzati per la diagnosi di influenza, questi includono test immunologici rapidi, test antigene diretto (DFA) e metodi di coltura virale. Immunologici rapidi drammaticamente mancano sensibilità 5-8, mentre gli altri due metodi sono di manodopera e richiede tempo 9. Test molecolari offrono molteplici vantaggi tra cui un breve tempo di ritorno, SENsit altaivity e una maggiore specificità. Diversi enti commerciali hanno lavorato per veloci test molecolari (chiamato anche test di acidi nucleici o NAT) per le malattie infettive, e molti saggi hanno influenza nelle loro condotte. Tuttavia la maggior parte di essi richiedono off-chip preparazione del campione. Nessuno degli emendamenti Clinical Laboratory Improvement (CLIA) hanno rinunciato test molecolari integrare la preparazione del campione nella cartuccia dosaggio o il modulo.
Lab-on-a-chip svolge un ruolo importante nello sviluppo di point-of-care test. Dopo l'introduzione del primo chip PCR nel 1993 10, numerosi sforzi sono stati messi in sviluppo chip di test di acidi nucleici. Tuttavia, solo pochi di questi hanno integrato preparazione grezza campione con amplificazione a valle.
Abbiamo precedentemente dimostrato la miniaturizzazione di una colonna di estrazione in fase solida (SPE) in un chip di plastica microfluidico 11 e lo svilupposviluppo e ottimizzazione di un chip a flusso continuo PCR 12. Qui, si estende la precedente lavoro di integrare la SPE con RT e PCR passi in un unico chip per la diagnostica clinica e dimostrare la sua capacità di amplificare gli acidi nucleici da paziente nasofaringei (NP) tamponi e aspirati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo diagnostico presentato qui dimostrato la capacità di un sistema integrato chip microfluidica plastica per amplificare influenzali RNA da campioni di pazienti con alta specificità e un limite di rilevabilità basso 13 Abbiamo progettato questo chip per potenziale punto di testing cura:. (A) la temperatura e fluidici controllo sono state semplificate, (b) il chip è a basso costo e adatto per fabbricazione ad alta con stampaggio ad iniezione, e (c), il chip è monouso e previsto per un solo uso, rid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (NIH) concessione R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Referências
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