Microfluïdische chip fabricage en methode om Influenza Detect
Summary
Een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip is ontwikkeld voor gebruik als een moleculaire diagnostische. De chip voert nucleïnezuur extractie, reverse transcriptase, en PCR. Werkwijzen voor het vervaardigen en gebruiken van een chip worden beschreven.
Abstract
Snelle en effectieve diagnostiek spelen een belangrijke rol in het controleren van infectieziekten door deze in staat effectieve behandeling van de patiënt en de behandeling. Hier geven we een geïntegreerde microfluïdische chip thermoplastische de mogelijkheid om influenza A virus in nasofaryngeale patiënt (NP) uitstrijkjes en zuigt amplificeren. Bij het laden van het monster, de microfluïdische apparaat voert sequentieel op-chip cellyse RNA zuivering en concentratie in de vaste fase extractie (SPE), reverse transcriptie (RT) en polymerase kettingreactie (PCR) in RT-PCR kamers, respectievelijk. Eindpunt detectie wordt uitgevoerd met behulp van een off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Voor randapparatuur, gebruikten we een injectiespuit pomp reagens en monsters rijden, terwijl twee dunne film verwarmingstoestellen werden gebruikt als warmtebron voor de RT en PCR kamers. De chip is ontworpen voor een laag en geschikt voor high throughput productie naar de Fabricati te verminderenop tijd en kosten. De microfluïdische chip biedt een platform voor allerlei virussen en bacteriën, alleen beperkt door veranderingen in ontwerp reagens om nieuwe pathogenen plaats detecteren analyseren.
Introduction
Miljoenen doden zijn gemeld tijdens de drie grieppandemieën van de 20e eeuw 1. Bovendien werd de meest recente grieppandemie uitgeroepen door de World Health Organization (WHO) 2 in 2009, en vanaf 1 augustus 2010, 18.449 sterfgevallen werden gemeld door de WHO 3. Deze pandemie toonde nogmaals de hoge belasting van besmettelijke ziekten, en de behoefte aan snelle en accurate detectie van influenza te vasten ziekte bevestiging, geschikt voor de volksgezondheid respons en effectieve behandeling 4 mogelijk te maken.
Er zijn verschillende methoden voor de diagnose gebruikte influenza, omvatten snelle immunoassays, direct fluorescent antigen testen (DFA) en virale kweekmethoden. Rapid immunoassays dramatisch niet gevoelig 5-8, terwijl de andere twee methoden zijn arbeidsintensief en tijdrovend 9. Moleculaire tests bieden meerdere voordelen, waaronder een korte doorlooptijd, hoge Sensitivity en hogere specificiteit. Verschillende commerciële entiteiten hebben gewerkt in de richting van een snelle moleculaire tests (ook wel nucleïnezuur tests of NAT) voor infectieziekten, en een aantal hebben influenza testen in hun pijpleidingen. Maar de meeste van hen vereisen off-chip monstervoorbereiding. Geen van de Clinical Laboratory Improvement Wijzigingen (CLIA) afgezien moleculaire tests monstervoorbereiding te nemen in de test cartridge of module.
Lab-on-a-chip technologie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van point-of-care tests. Na de introductie van de eerste PCR chip in 1993 10 zijn talrijke inspanningen aan het ontwikkelen nucleïnezuur test chips. Echter, slechts een paar van deze zijn geïntegreerd ruwe monstervoorbereiding met downstream versterking.
We hebben eerder aangetoond miniaturisatie van een vaste fase extractiekolom (SPE) in een plastic microfluïdische chip 11 en de ontwikkelingment en optimalisatie van een continue stroom PCR chip 12. Hier breiden we het eerdere werk van de SPE te integreren met RT-en PCR-stappen in een enkele chip voor klinische diagnostiek en blijk geven van haar vermogen om nucleïnezuren van de patiënt nasofaryngeale (NP) swabs en zuigt versterken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De diagnostische methode hier gepresenteerde aangetoond over het vermogen van een geïntegreerde microfluïdische plastic chip aan influenza A RNA versterken van patiënt monsters met hoge specificiteit en een lage detectielimiet 13 Wij ontwierpen deze chip voor potentiële point of care testen:. (A) de temperatuur en vloeibare controle werden vereenvoudigd, (b) de chip is goedkoop en geschikt voor high throughput fabricage met behulp van spuitgieten, en (c) de chip is disposable en bestemd voor eenmalig gebr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Referências
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
