Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.
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Artigo de método
Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe
Neste artigo
Resumo
Resumo
Diagnóstico rápidos e eficazes têm um papel importante no controle de doenças infecciosas, permitindo que a gestão do paciente e tratamento eficazes. Aqui, apresentamos um chip microfluídico integrado termoplástico com a capacidade de amplificar vírus influenza A em paciente nasofaringe (NP), esfregaços e aspirados. Durante o carregamento da amostra do paciente, o dispositivo micro sequencialmente realiza on-chip a lise das células, purificação e concentração de RNA dentro da extracção em fase sólida (SPE), a transcrição reversa (RT) e de reacção em cadeia da polimerase (PCR), em câmaras de RT-PCR, respectivamente. Detecção do ponto final é realizada usando um Bioanalyzer off-chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para os periféricos, utilizou-se uma bomba de seringa para dirigir reagentes e amostras, ao passo que dois aquecedores de película fina foram utilizadas como fontes de calor para a temperatura ambiente e as câmaras de PCR. O chip é desenhado para ser de camada única e adequado para o fabrico de elevado rendimento para reduzir o Fabricatiem tempo e custo. O chip microfluídico proporciona uma plataforma para analisar uma grande variedade de vírus e bactérias, limitado apenas pelas mudanças na concepção reagente necessários para detectar novos agentes patogénicos de interesse.
Introdução
Milhões de mortes foram relatadas durante os três pandemias de gripe do século 20 1. Além disso, a pandemia de gripe mais recente foi declarada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) 2, em 2009, e em 1 de agosto de 2010, 18.449 mortes foram registradas pela OMS 3. Esta pandemia demonstrou mais uma vez a alta carga de doenças infecciosas, e da necessidade de rápida e precisa detecção de gripe para ativar a confirmação da doença rápida, resposta adequada de saúde pública e tratamento eficaz 4.
Existem vários métodos utilizados para o diagnóstico da gripe, que incluem imunoensaios, ensaios rápidos....
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Protocolo
1. Fabricação de chips 12
- Fazer duas placas de aglomerados Zeonex 690R: distribuir 8-9 gramas pelotas Zeonex uniformemente no centro de uma placa de metal, o pré-aquecimento na prensa aquecida a 198 ° C durante 5 min e, em seguida, aplicar a pressão lentamente até 2500 psi, durante mais 5 min. Para concluir esta etapa, foi utilizado um Carver imprensa quente.
- Grava o canal microfluídico na placa com um molde de epóxi. Os detalhes sobre a fabricação do molde são descritos em outra parte 12 (canal de desenho na Figura 2b): colocar uma placa sobre o molde epóxi; preaquecimento los na prensa aquecida a 157 ° C d....
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Resultados
Um resultado típico é mostrado na Figura 3, para uma amostra de influenza A lavagem nasofaríngeo infectado. Devido às diferentes quantidades de vírus influenza em cada amostra de paciente, a concentração final de produto de PCR pode variar. Um bom resultado deve ter baixo ruído, dois picos escada claras (35 e 10380 pb) e um pico único produto com o tamanho do produto concebido (107 pb) para a amostra positiva. Enquanto que o pico do produto deveria, teoricamente, estar ausente dos controlos negati.......
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Discussão
O método de diagnóstico aqui apresentados demonstram a capacidade de um chip microfluídico integrado plástico para amplificar influenza A RNA a partir de amostras de pacientes com elevada especificidade e um limite de detecção de baixo 13 Concebemos este chip para o ponto de teste de potencial cuidado:. (A) a temperatura do fluido e controle foram simplificados, (b) o chip é de baixo custo e conveniente para a fabricação de alto rendimento usando moldagem por injecção, e (c) o chip é descartável e destinado a.......
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Divulgações
Os autores declararam não interesses concorrentes financeiros.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health (NIH) concessão R01 EB008268.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / Material | Companhia | Número de Catálogo | |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzofenona | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Metacrilato de butilo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| RNA Transportador | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Ciclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Etanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Dimetacrilato de etileno | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Dimetacrilato de etilenoglicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335.681-100ML | |
| Seringa de vidro de 250 jil | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Tiocianato de guanidina | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| Kit DNA Alta Sensibilidade | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Prensagem a quente | Carver, Wabash, EM | 4386 | |
| JB Weld Epóxis | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok seringas | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Cloreto de Magnésio | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Metacrilato de metilo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Científico | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Científico | F-120x | |
| Água livre de nuclease | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR Kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Fonte de alimentação | VWR, Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Fora | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Sílica microesferas | Polysciences, Warrington, PA | 24324-15 | |
| Bomba de seringa | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Tape termicamente condutiva | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Par termoelétrico | Omega Engenharia, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Película fina Aquecedores | Minco, Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Crosslinker ultravioleta | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Referências
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organ....
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Reimpressões e permissões
