Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza
Summary
Un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico ha sido desarrollado para su uso como un diagnóstico molecular. El chip realiza la extracción de ácido nucleico, la transcriptasa inversa y la PCR. Los métodos para fabricar y ejecutar el chip se describen.
Abstract
Diagnósticos rápidos y eficaces desempeñan un papel importante en el control de enfermedades infecciosas al permitir la gestión eficaz del paciente y el tratamiento. Aquí, se presenta un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico con la capacidad de amplificar el virus en pacientes nasofaríngeas (NP) frotis y aspirados. Después de cargar la muestra del paciente, el dispositivo de microfluidos secuencialmente lleva a cabo en el chip lisis celular, la purificación del ARN y otra de concentración dentro de la extracción en fase sólida (SPE), transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en RT-PCR cámaras, respectivamente. Punto final de la detección se realizó usando un Bioanalyzer fuera de chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Por periféricos, se utilizó una bomba de jeringa de un solo reactivo para conducir y muestras, mientras que dos calentadores de película fina se utilizaron como fuentes de calor para la RT y PCR cámaras. El chip está diseñado para ser de una sola capa y adecuado para la fabricación de alto rendimiento para reducir la fabricatien tiempo y costo. El chip microfluídico proporciona una plataforma para analizar una amplia variedad de virus y bacterias, limitado sólo por cambios en el diseño de reactivos necesarios para detectar nuevos patógenos de interés.
Introduction
Millones de muertes han sido reportadas durante las tres pandemias de influenza en el siglo 20 1. Por otra parte, la pandemia de influenza más reciente fue declarada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), dos en 2009, y el 1 de agosto de 2010, 18.449 muertes fueron reportadas por la OMS 3. Esta pandemia ha demostrado una vez más la elevada carga de enfermedades infecciosas, y la necesidad de una detección rápida y exacta de la gripe a activar la confirmación de la enfermedad rápidamente, la respuesta de salud pública apropiada y un tratamiento efectivo 4.
Hay varios métodos utilizados para el diagnóstico de la gripe, que incluyen inmunoensayos rápidos, pruebas de antígeno fluorescente directa (DFA) y los métodos de cultivo viral. Inmunoensayos rápidos dramáticamente carecen de sensibilidad 5-8, mientras que los otros dos métodos son de trabajo intensivo y requiere mucho tiempo 9. Las pruebas moleculares ofrecen múltiples ventajas, incluyendo un vuelco corto tiempo, Sensit altoividad, y una mayor especificidad. Varias entidades comerciales han estado trabajando para pruebas moleculares rápidas (también llamadas pruebas de ácido nucleico o NAT) para las enfermedades infecciosas, y varios tienen pruebas de influenza en sus tuberías. Sin embargo la mayoría de ellos requieren fuera de chip preparación de la muestra. Ninguna de las Enmiendas de Mejoras de Laboratorio Clínico (CLIA) renunciaron pruebas moleculares incorporar preparación de la muestra en el cartucho de ensayo o módulo.
Lab-on-a-chip desempeña un papel importante en el desarrollo de dispositivos de prueba en el punto de atención. Después de la introducción de la primera chip de PCR en 1993 10, numerosos esfuerzos se han puesto en el desarrollo de chips de prueba de ácidos nucleicos. Sin embargo, sólo unos pocos de estos tienen preparación integrada muestra en bruto con la amplificación aguas abajo.
Hemos demostrado anteriormente la miniaturización de una columna de extracción en fase sólida (SPE) en un chip microfluídico de plástico 11 y desarrollar lación y optimización de un flujo continuo de chip PCR 12. Este sentido, ampliar el trabajo previo para integrar la SPE con RT y PCR medidas en un solo chip para el diagnóstico clínico y demostrar su capacidad para amplificar los ácidos nucleicos de los pacientes nasofaríngeo (NP) hisopados y aspirados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de diagnóstico presentados aquí demuestran la capacidad de un sistema integrado de chip de plástico microfluídico para amplificar ARN influenza A partir de muestras de pacientes con alta especificidad y un bajo límite de detección 13 Se diseñó este chip para el punto de potencial de las pruebas de atención:. (A) la temperatura y fluídico el control se simplifica, (b) el chip es de bajo costo y adecuadas para la fabricación de alto rendimiento utilizando moldeo por inyección, y (c) el ch…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Referências
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