微流控芯片的制备及方法检测甲型流感
Summary
一个集成的微流体热塑性芯片已被开发用于作为一种分子诊断。该芯片进行核酸提取，逆转录和PCR。用于制造和运行芯片的方法中描述。
Abstract
快速和有效的诊断中发挥了重要作用，实现有效的病人管理和治疗，在控制传染病。在这里，我们提供了一个完整的微热塑性芯片的能力放大A型流感病毒在患者鼻咽部拭子和吸出物（NP）。当加载的患者样本，微流器件依次进行的片上的细胞裂解，RNA的纯化和浓缩步骤的固相萃取（SPE），反转录（RT）和聚合酶链反应（PCR），在RT-PCR室内，分别。终点检测使用片外生物分析仪（安捷伦科技，圣克拉拉，CA）。用于外围设备，我们使用一个单一的注射器泵进行驱动的试剂和样本，而两个薄膜加热器用作热源的RT和PCR室。该芯片被设计成单一的层和适合高吞吐量制造减少fabricati的时间和成本。微流控芯片分析各种病毒和细菌，只限于需要发现新的病原体的试剂设计提供了一个平台。
Introduction
据报道，在20世纪的三次流感大流行的数以百万计的人死亡。此外，最近的流感大流行是在2009年由世界卫生组织（WHO）宣布，截至2010年8月1日报道了世界卫生组织3，18,449人死亡。再次证明了这一流行病的高负担的传染性疾病，需要进行流感快速，准确的检测，实现快速疾病的确认，适当的公共卫生反应和有效的治疗方法4。
广泛用于诊断流感的方法有好几种，包括快速免疫测定，直接荧光抗原测试（DFA）和病毒培养方法。快速免疫显着缺乏敏感性5-8，而其他两种方法是劳动密集和耗时9。分子检测提供了多种优势，包括短匝左右的时间，高SENSITivity，和较高的特异性。的一些商业机构已着手对快速分子检测（也称为核酸检测或NAT）的传染性疾病，和一些有流感检测管线。但他们中的大多数需要关闭芯片的样品制备。没有放弃的分子测试将样品制备到试验盒或模块的临床实验室改进修正案（CLIA）。
实验室上的一个芯片技术点医疗检测设备的发展起着重要的作用。出台后的第一个PCR芯片在1993年10，无数的努力，已投入开发核酸检测芯片。然而，只有少数的这些集成的粗样品制备与下游扩增。
之前我们已经证实成塑料微流体芯片11的小型化的固相萃取柱（SPE）和开发和优化的连续流PCR芯片12。在这里，我们扩展了以前的工作整合到一个芯片上，为临床诊断和SPE与RT和PCR步骤展示其能力，从病人鼻咽部拭子和吸出物（NP）核酸扩增。
Protocol
1。芯片制造12 车型两个斑块从ZEONEX 690R粒料：8-9克ZEONEX粒料均匀地分配在中心上的金属板，预热5分钟，在198℃下加热的压榨，然后慢慢地施加压力2500 psi的另外5分钟。要完成这一步，我们使用了卡弗热压。 浮雕微流体通道中的牌匾用环氧模。在模具上制造的详情概述别处12（在图2b中的通道设计）：把一个斑块上的环氧模;预热他们的热压机上，在157℃?…
Representative Results
一个典型的结果显示在图3为A型流感感染的鼻咽冲洗标本。由于流感病毒的不同量的每个患者标本中，PCR产物的终浓度会有所不同。一个很好的结果应具有低噪声，两个明显的阶梯峰值（35和10380 bp的）和一个单一的产物峰，在所设计的产品的尺寸（107 bp）的阳性样品。虽然产物峰，理论上应该不存在为阴性对照，我们确实观察到虚假的PCR峰在一些样品中引物二聚体的形成附近的?…
Discussion
这里给出的诊断方法表现出的能力的集成微流控塑料芯片从患者标本放大A型流感RNA，具有较高的特异性和检出限低， 我们设计该芯片潜在照顾测试点：（一）温度和流体控制被简化，（b）该芯片是成本低，适合于高吞吐量的制造，使用注射成型，及（c）的芯片是一次性的，并且预期的一次性使用，从而降低样品的交叉污染的关注。
虽然我们目前的芯片上的运行时?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助R01 EB008268。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Referências
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
Citar este artigo
Cao, Q., Fan, A., Klapperich, C. Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza. J. Vis. Exp. (73), e50325, doi:10.3791/50325 (2013).