Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe
Summary
Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.
Abstract
Diagnóstico rápidos e eficazes têm um papel importante no controle de doenças infecciosas, permitindo que a gestão do paciente e tratamento eficazes. Aqui, apresentamos um chip microfluídico integrado termoplástico com a capacidade de amplificar vírus influenza A em paciente nasofaringe (NP), esfregaços e aspirados. Durante o carregamento da amostra do paciente, o dispositivo micro sequencialmente realiza on-chip a lise das células, purificação e concentração de RNA dentro da extracção em fase sólida (SPE), a transcrição reversa (RT) e de reacção em cadeia da polimerase (PCR), em câmaras de RT-PCR, respectivamente. Detecção do ponto final é realizada usando um Bioanalyzer off-chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para os periféricos, utilizou-se uma bomba de seringa para dirigir reagentes e amostras, ao passo que dois aquecedores de película fina foram utilizadas como fontes de calor para a temperatura ambiente e as câmaras de PCR. O chip é desenhado para ser de camada única e adequado para o fabrico de elevado rendimento para reduzir o Fabricatiem tempo e custo. O chip microfluídico proporciona uma plataforma para analisar uma grande variedade de vírus e bactérias, limitado apenas pelas mudanças na concepção reagente necessários para detectar novos agentes patogénicos de interesse.
Introduction
Milhões de mortes foram relatadas durante os três pandemias de gripe do século 20 1. Além disso, a pandemia de gripe mais recente foi declarada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) 2, em 2009, e em 1 de agosto de 2010, 18.449 mortes foram registradas pela OMS 3. Esta pandemia demonstrou mais uma vez a alta carga de doenças infecciosas, e da necessidade de rápida e precisa detecção de gripe para ativar a confirmação da doença rápida, resposta adequada de saúde pública e tratamento eficaz 4.
Existem vários métodos utilizados para o diagnóstico da gripe, que incluem imunoensaios, ensaios rápidos antigénio directa fluorescente (DFA) e os métodos de cultura viral. Imunoensaios rápidos dramaticamente falta de sensibilidade 5-8, enquanto que os outros dois métodos são muito trabalhosa e demorada 9. Os testes moleculares oferecem múltiplas vantagens, incluindo um curto tempo de rotação SensIT, de altaivity, e maior especificidade. Várias entidades comerciais têm vindo a trabalhar no sentido rápidos testes moleculares (também chamados de testes de ácidos nucleicos ou NAT) para doenças infecciosas, e vários ensaios têm influenza em suas condutas. No entanto a maior parte deles necessitam off-chip de preparação da amostra. Nenhuma das alterações Clinical Laboratory Improvement (CLIA) renunciou testes moleculares incorporar a preparação da amostra para o cartucho de ensaio ou módulo.
Lab-on-a-chip desempenha um papel importante no desenvolvimento de dispositivos de point-of-care de teste. Após a introdução do chip primeira PCR, em 1993, 10, numerosos esforços têm sido feito para desenvolver chips de teste de ácido nucleico. No entanto, apenas alguns deles têm a preparação da amostra integrado bruto com amplificação a jusante.
Temos anteriormente demonstrada a miniaturização de uma coluna de extracção em fase sólida (SPE) em um chip microfluídico plástico 11 ea desenvolvermento e otimização de um contínuo fluxo de chip de PCR 12. Aqui, nós estendemos o trabalho anterior para integrar a SPE com RT e as etapas de PCR em um único chip para diagnósticos clínicos e demonstrar a sua capacidade para amplificar ácidos nucléicos de paciente nasofaringe (NP), esfregaços e aspirados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de diagnóstico aqui apresentados demonstram a capacidade de um chip microfluídico integrado plástico para amplificar influenza A RNA a partir de amostras de pacientes com elevada especificidade e um limite de detecção de baixo 13 Concebemos este chip para o ponto de teste de potencial cuidado:. (A) a temperatura do fluido e controle foram simplificados, (b) o chip é de baixo custo e conveniente para a fabricação de alto rendimento usando moldagem por injecção, e (c) o chip é descartável …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health (NIH) concessão R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Referências
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