Summary
I denne publikasjonen beskrives en hurtig og bekvem fremgangsmåte for isolering og dyrking av primære acinøse celler fra murin bukspyttkjertelen. Denne metoden utgjør en verdifull tilnærming for å studere fysiologi av friske primære normale / utransformerte eksokrine bukspyttkjertelen celler.
Abstract
Denne protokollen tillater hurtig isolering (i mindre enn 1 time) av murin pankreatisk acini, noe som gjør det mulig å opprettholde dem i kultur i mer enn en uke. Mer enn 20 x 10 6 akinærceller kan fås fra en enkelt murin bukspyttkjertel. Denne protokollen gir muligheten til selv å behandle så mange som 10 bukspyttkjertler parallelt. Fordi den bevarer acinar arkitektur, er denne modellen godt egnet til å studere fysiologi av eksokrin pankreas in vitro i motsetning til cellelinjer etablert fra svulster i bukspyttkjertelen, som viser mange genetiske forandringer som resulterer i delvis eller totalt tap av deres acinar differensiering.
Introduction
En hyppig oppstått problem for forskningslaboratorier som arbeider med eksokrin pankreatisk vev er vanskeligheten med å dyrke akinærceller in vitro hos et tidsrom lenge nok til å tillate et langtidsforsøk.
En faktor som hindrer utvikling av slike dyrkingssystemer er den iboende følsomheten av pankreatisk vev til eksperimentell manipulasjon på grunn av det høye innhold i glykolysen, proteolytisk og lipolytisk enzymer, som bokstavelig talt fordøye pankreasvevet når de er frigjort under isolering av pankreatiske celler.
En annen faktor er bemerkelsesverdig in vitro plastisitet av akinærceller, som har en tendens til å miste sine sekretoriske egenskaper og transdifferentiate til andre modne celler, for eksempel bukspyttkjertelen duktale celler eller hepatocyte-lignende celler en. In vitro, varierer denne cellen plastisitet med de eksperimentelle forhold (for eksempel kulturmediet sammensetning) 2 en.
Flere metoder er blitt utviklet for isolering og kulturen av akinærceller, først fra marsvin pankreas 3-5. I utgangspunktet disse protokollene involvert fordøyelsen av bukspyttkjertelen vev med collagenase, chymotrypsin, og en protease cocktail, med ultimate isolasjon av kraftig mekanisk dissosiasjon. Bukspyttkjertelen celler isolert på denne måten viste unormale strukturelle og funksjonelle egenskaper, særlig tap av apikale strukturer og betydelig skade på deres membranreseptorer. Isolerte celler forble levedyktige i bare en eller to dager.
Fremstilling av dispergert acini opprettholder deres intra-og intercellulær arkitektur, bevare cellemembraner, begrense skade på overflatereseptorer, og dermed forbedre eksokrin sekresjon i respons til secretagogues 6-8. Som et result, tilbyr denne metoden den store fordelen av å utvide acinar celleviabilitet til 7-10 dager in vitro. Videre er denne metoden for tiden foretrukket å acinar celleisolasjon 9-12 fordi vedlikehold av intercellulær kontakter, inkludert celle koblingen ved gap veikryss, er en viktig faktor for den eksokrin pankreas acinar cellefenotype 13.
Som dedifferentiation av akinærceller og deres transdifferentiation til ductal celler er en av de foreslåtte mekanismene for dannelsen av aggressive eksokrine pankreas cancer 14, er den dispergerte acini modellen også et tilfredsstillende system for å studere pankreatisk plastisitet og dets påfølgende molekylære mekanismer. Videre, i kombinasjon med bruken av genetisk modifiserte dyr 15,16 og utvikling av teknikker for genoverføring (adenoviral to eller lentiviral transduksjon, bruk av nanopartikler, etc), vil denne in vitro primære acinøs cellemodell kanvære svært nyttig for å bestemme hvordan ulike genetiske dysfunksjoner påvirke reguleringen av acinar celledifferensiering eller dedifferentiation og bør gi bedre forståelse av molekylære hendelsene ansvarlige for utbruddet av pankreatitt, forstadier til kreft, og endringer i celle plastisitet.
Isolering av dispergert acini er den tilnærmingen vi bruker i vårt laboratorium til kultur acinøse celler. Vi her beskriver og drøfter hvilken metode som brukes. Det innebærer enzymatisk dissosiasjon av pankreatisk vev (med en bakteriell kollagenase) koplet til mekanisk forstyrrelse uten dissosiering av akinærceller. Mens de fleste protokollene innebærer dyrking av acini, enten i suspensjon eller på spesialbehandlede plastunderlag, vokser vi dem i suspensjon bare en kort stund (24 timer), såing dem etterpå på matrix stillasene dersom forlenget cellekultur er nødvendig.
Denne protokollen tillater rask isolasjon (på mindre enn 1 time) av dispergert bukspyttkjertelen acini, bærekraftig for mer enn én uke i kultur. Det tillater isolering av mer enn 20 x 10 6 akinærceller pr mus bukspyttkjertel. Dens enkelhet gjør det mulig å bearbeide uavhengig av hverandre så mange som 10 bukspyttkjertler parallelt. Ved å opprettholde den intra-og intercellulært arkitektur acini og dermed acinar fenotype av isolerte primære celler, utgjør denne modellen et system av valget for studiet av transdifferentiation mekanismer, som alle andre eksokrine pankreas modeller tilgjengelig er avledet fra svulster i bukspyttkjertelen viser mange genetiske endringer som fører til cellulær transformasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av en etikk komité under regulatorisk av offentlig myndighet ("Comité d'Evaluation Commun au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de transit de l'ENS, au PBES et au laboratoire P4" (CECCAPP)). Mus ble opprettholdt i en bestemt patogen-fri dyr anlegget på "Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard" (Lyon, Frankrike) og håndteres i samsvar med de institusjonelle retningslinjer.
En skjematisk representasjon av fremgangsmåten er vist i figur 1..
En. Pancreas Dissection og Dilaceration (Dag 0)
En meget hurtig disseksjon er kritisk for et optimalt utbytte av ekstraksjon og for å sikre en god levedyktighet av celler i kultur. For å redusere den tiden som trengs for bukspyttkjertelen isolasjon, må alle instrumenter og utstyr være klar før musen dødshjelp.
- Avlive mus med CO 2 kvelning eller halshugging.
Fra dette trinnet, alle prosedyrer må utføres under en steril atmosfære (mikrobiologisk sikkerhet kabinett, nivå II) med sterilt disseksjon utstyr.
- Fest musen og spray musen magen med 70% etanol. Med noen dissekere saks og pinsett, lage en V-formet snitt på underlivet og fortsetter det opp til membranen for å åpne helt bukhulen.
- Plasser leveren fliker mot mellomgulvet, de bør forbli der hvis kroppens hulrom er åpen langt nok. Trekk tarmen og tykktarmen utenfor bukhulen til venstre, og finn endetarmen. Med et par buede tenger og dissekere saks, grip og § endetarmen.
- Med samme pinsett, forsiktig rulle helt tarmen fra endetarmen til magen ved å trekke i tarmen på venstre side.
- Ved hjelp Noyes saks og en pinsett, må du kutte bukspyttkjertelen langs tarmen og frigjøre det med milten fra resten av fordøyelseskanalen.
- Ta tak i milten og § bukspyttkjertelen knyttet til det (figur 2).
På dette trinnet, være sikker på at ingen mesentrialfett vev og / eller andre tilstøtende vev (milt, tarm, etc.) kan bli samlet med bukspyttkjertelen, for å unngå forurensning cellulære.
For resten av prosedyren, må alle buffere fremstilles uten kalsiumioner Ca2 + chelatorer for å unngå fullstendig dissosiasjon av eksokrin pankreatisk vev i enkelt akinærceller.
- Skyll bukspyttkjertelen to ganger i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1x.
På dette trinnet, vil som fettvev flyte strid med bukspyttkjertelen som vil synke, er det lett mulig å visualisere og raskt fjerne forurensningen hvitt fettvev fortsatt knyttet til bukspyttkjertelen.
Hvis bukspyttkjertelen må transporteres til den cellekultur anlegget, må det holdes på is i HBSS 1x.
- Overfør bukspyttkjertelen i en steril petriskål som inneholdt 5 ml med HBSS 1x. Ved hjelp Noyes saks og en skalpell, skjære bukspyttkjertelen i små biter av 1 til 3 mm 3 (figur 3A).
2. Enzymatiske og mekaniske Dissociations av Pancreas (Dag 0)
- Overføre dem inn i en steril 50 ml polypropylenrør.
- Sentrifuger i 2 min ved 450 x g og 4 ° C. Aspirer og kast supernatanten for å fjerne celle fragmenter og blodceller.
- Tilsett 10 ml kollagenase IA-løsning (1x HBSS inneholdende 10 mM HEPES, 200 U / ml collagenaSE IA, og 0,25 mg / ml trypsin-inhibitor) for Pankreas seksjoner. Ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette, overføre dem til en 25 cm 2 kolbe. Inkuber det i 20-30 min ved 37 ° C. I løpet av denne tiden (hvert 5 min), utføre en mekanisk dissosiasjon av energisk flytte tilbake-og-tilbake bukspyttkjertelen fragmenter omtrent ti ganger, i sterile pipetter med synkende størrelse (25, 10 og 5 ml serologiske pipetter).
På dette trinnet er det viktig å hyppig overvåke utstrekningen av den enzymatiske dissosiasjon av pankreas seksjoner.
- Når pankreasvevet synes å være vel-dissosiert (i henhold til forsvinning av pankreas fragmenter og til økt turbiditet av oppløsningen) (figur 3B), å stoppe den enzymatiske reaksjonen ved tilsetning av 10 ml kald bufret vaske-løsning (1x HBSS inneholdende 5 % kalvefosterserum (FBS) og 10 mM HEPES).
- Overfør den inn i en steril 50 ml polypropylenrør og centrifuge i 2 min ved 450 x g og 4 ° C. Nøye aspirer og kast supernatanten å fjerne collagenase IA løsning.
- Resuspender pelleten og vask med 10 ml bufret vaskeoppløsning. Sentrifuger i 3 min ved 450 x g og 4 ° C. Nøye aspirer og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet to ganger til.
3. Filtrering og Seeding av Spredt acini (Dag 0)
- Resuspender cellepelleten i 7 ml Waymouth medium inneholdende 2,5% FBS, 1% penicillin-streptomycin-blanding (PS), 0,25 mg / ml trypsin-inhibitor, og 25 ng / ml rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF).
- Filtrat celleblandingen ved å la den passere gjennom en 100 mikrometer filter for å beholde den ikke-fordøyde fragmenter (kanaler, blodårer, og Langerhans holmer). Acinøse strukturer (acinus av 10-15 celler) passere gjennom.
- Skyll filteret med 6 ml Waymouth medium inneholdende FBS, PS, trypsin inhibitor, og EGF.
Etter dette trinnet, cellene må behandles meget forsiktig, for å unngå enhver acini dissosiasjon.
- Seed den isolerte acini i en 6-brønnen kultur tallerken (2 ml per brønn) (Figur 3C). Kultur dem ved 37 ° C under 5% (volum / volum) CO2 atmosfære.
Etter dette trinnet, blir de akinærceller dyrket i suspensjon.
4. Acinar Cell Culture (dag 1 til 10)
- Tjuefire timer etter, overføre acini (i suspensjon) inn i en ny 6-brønnen kultur tallerken, for å eliminere forurensningen celler og cellulære rester som har levd over natten (figur 4).
Hvis cellekultur må utvides for flere dager, eller hvis de eksperimentelle forholdene krever celler dyrket i monolag, anbefales det å overføre og frø acini på matrisegrupper stillaser.
- Dagen før seding på matrix støtte (dag 0), strøk en 6-brønnen kultur tallerken med type I kollagen (5 mikrogram / cm 2). Tilsett 1 ml av type I-kollagen-løsning (50 ug / ml i 0,02 M eddiksyre, 0,2 um-filtrert) til hver brønn og la den passivt adsorberes plast, i løpet av en time ved 37 ° C (eller over natten ved 4 ° C ).
- Aspirer type I kollagen løsning, og skylle den belagte godt to ganger med fosfatbuffret saltoppløsning 1x.
- Tillat den belagte godt å tørke (under en mikrobiologisk sikkerhetsskap) minst 12 t før bruk.
- Overfør den isolerte primære acini (oppnådd i trinn 4.1) i type I kollagen-belagt 6-brønners dyrkings-fatet og kulturen dem i de samme betingelser som tidligere beskrevet (ved 37 ° C under 5% (volum / volum) CO2 atmosfære) . Cellene holder seg til type I kollagen substrat i 2 dager.
- På dag 3, endrer kulturmediet for å eliminere ikke-levedyktige celler som ikke er overholdt. Med tiden i kultur, cellene vil gradvis splese på kollagen-holdig støtte. Endre kulturen medium hver 3. dag (figur 5).
De isolerte akinærceller fremkommer kan telles, etter en fullstendig mekanisk dissosiasjon ved hjelp av en celle Thoma tellekammer. Merk at isolerte akinærceller ikke kan opprettholdes i kultur etterpå.
Kvaliteten på acinar kultur innhentet kan kontrolleres ved å sjekke uttrykk for acinøse spesifikke markører som Trypsinogen, Pancreas transkripsjonsfaktor en underenhet Alpha, eller Carboxypeptidase A1 (ved immunocytochemistry eller immunofluorescence eksperimenter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 schematizes den "spredt" acini metode for primær acinar celler isolasjon. De kritiske trinn, som må være strengt respektert under protokollen, er beskrevet i diskusjonen delen.
For å lette dets fjerning, har bukspyttkjertelen til å bli samlet fra bukhulen sammen med den vedlagte milten (figur 2). Begge organer må kuttes fra hverandre, og det gjenværende fett vev som kan bli fortsatt festet til bukspyttkjertelen må fjernes (trinn 1.6).
Den makro-og mikroskopiske bilder, som er vist i figur 3, representerer resultatet etter hvert enkelt trinn i de enzymatiske og mekaniske dissociations i bukspyttkjertelen. Etter kutting, er bukspyttkjertelen delt i små deler (figur 3A; Trinn 1.8). Figuren 3B viser aspektet i bukspyttkjertelen etter en vellykket enzymatisk dissosiasjon avhengig av en forsiktig temporal overvåking av den pågående fordøyelsen (trinn 2.4). Dette trinnet er et viktig skritt for å fastslå den eksakte tiden som er nødvendig. Den Figur 3C viser den oppnådde materiale etter filtrering av pankreas-blandingen (trinn 3.4). Bare godt separerte acini holdes etter dette trinnet.
Den Figur 4 er en typisk illustrasjon på dag 1 pankreatisk acini isolert ved anvendelse av vårt protokollen. Overføringen av akinærceller inn i en ny kultur tallerken tillater å eliminere de cellulære fragmenter og de adherente kontaminerende celler (trinn 4.1).
Som vist i figur 5, når dyrket på type I kollagen, akinærceller spre seg og mister sin acinøs differensiering (morfologi og 3D organisasjon), som gir opphav til et monolag av spindel-formede celler (trinn 4.6).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av protokollen tillater isolering av mus primære spredt acini.
Figur 2. Brutto anatomi i bukspyttkjertelen etter disseksjon. Røde og gule piler henholdsvis indikerer de gjenværende anatomiske forbindelser med milten og mesenteric fettvev som må kuttes for bukspyttkjertelen samling.
Figur 3. Spredt acini isolasjon (Dag 0) visualisert ved makroskopiske observasjon (venstre panel) og fase-kontrast mikroskopi (høyre panel, 40X forstørrelse). A) Etter dilaceration (vist i en 25 cm 2 kolbe). B) Etter collagenase IA fordøyelse og sprek mekanisk dissociatipå. C) Etter filtrering og transfer i en 6-brønnen kultur parabolen.
Figur 4. Spredt acini kultur, 24 timer etter såing (Dag 1), visualisert ved fase-kontrast mikroskopi (40X forstørrelse).
Figur 5. Spredt acini kultur på en type I kollagen-belagt fatet på dag 2, 4 og 7 visualisert ved fase-kontrast mikroskopi (40X, 120x og 240x forstørrelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en prosedyre for å isolere acinøse celler. Denne metoden gjør det mulig å isolere mer enn 20 x 10 6 akinærceller per dyr på mindre enn 1 time. Takket være sin raske og enkel implementering (så mange som 10 pancreases kan være uavhengig behandlet per eksperiment i parallell), vises denne protokollen som et godt kompromiss mellom eksisterende isolasjon metoder 3-5,9-12,17.
Kritiske trinn / feilsøking
Effektiviteten av denne metoden er avhengig av forholdsregler er tatt på noen kritiske punkter. Det første trinnet i bukspyttkjertelen dilaceration (trinn 1.8) er avgjørende for påfølgende bukspyttkjertelen enzymatisk fordøyelse. Utilstrekkelig oppskjæringen vil redusere utbyttet av enzymatisk dissosiasjon og antallet av akinærceller oppnådd. Dette gjør det nødvendig å forlenge inkubasjon med collagenase IA, uunngåelig fører til en overdreven dissosiasjon av akinærceller og consecutivt økende celledød.
Som advarte ovenfor, er det andre kritiske trinnet fordøyelsen ved collagenase IA (trinn 2.3). For mye enzymatisk dissosiasjon fører til en høy grad av celledød. Omfanget av bukspyttkjertelen fordøyelsen må gjentas ofte i denne kritiske trinn (Figur 3B). Etter mekaniske og enzymatisk dissociations, trenger spesiell oppmerksomhet for å bli betalt for å kunne veldig forsiktig håndtere spredt acini for å bevare sine intracellulære strukturer.
Begrensninger
Selv om tilsetningen av epidermal vekstfaktor (EGF) i Waymouth kultur kan utfelle den progressive acinøs-til-ductal transdifferentiation, er det viktig å opprettholde cellene i live.
Som beskrevet i protokollen, og hvis nødvendig, kan in vitro dyrking periode av akinærceller utvides til opp til 10 dager etter såing av cellene i matrisen stillasåringer som type I kollagen. Ennå viktigere, og som vist av andre 1, dyrking celler på type I kollagen vil indusere den progressive transdifferentiation av akinærceller til duktale celler. Denne prosessen starter etter 4 dagers kultur på kollagen og kan være fullstendig etter 7 dager. Det kan derfor være nødvendig å se på tilstedeværelsen av en bestemt duktale markør som Cystisk fibrose transmembrane Conduktans Regulator eller Cytokeratin-19 (ved immunocytochemistry eller immunofluorescence eksperimenter) hvis acinar cellekultur må utvides til en uke. Den alternative bruk av Matrigel som en matrise stillas, ved å redusere vedheftingsevne dispergert acini, gjør det mulig å utvide det gjelder vedlikeholdet av acinøs fenotype i 2 dager.
Mulige endringer
Seksjonering endetarmen under disseksjon trinnet øker risikoen for bakterieangrep. Vi har aldri opplevd en slik situasjon. Imidlertid, hvis det er nødvendig, er en annen fremgangsmåte for å omgå dette problemet er mulig. Den består av å finne den mage, milt og den første delen av duodenum, og snitting vedlagte bukspyttkjertel. Legg merke til at denne alternative fremgangsmåte må være helt beherskes. Ellers vil varigheten av disseksjon bli lengre, da risikere kvaliteten av det fjernede biologisk materiale.
Den langsiktige monolag kultur av akinærceller kan optimaliseres, særlig ved å modifisere bærermassen. Hvis det kreves av de eksperimentelle betingelser, type I kollagen kan erstattes med et annet stillas, slik som Matrigel. I dette tilfellet må Matrigel være tilberedes ved 400 ug / ml konsentrasjon i kald fosfatbuffret saltoppløsning 1x. Deretter blir brønnene inkubert med Matrigel (40 mikrogram / cm 2) over natten ved 4 ° C. Dette punktet må være strengt respekteres. Kulturen prosedyren forblir den samme som beskrevet i trinn 4..
Metoden can bli ytterligere optimalisert empirisk. For eksempel kan mengden av aminosyrer i dyrkingsmediet av eksokrine pankreas-celler regulere proteinsyntesen i disse celler 18. Sphyris et al. 2. og BLAUER et al. 19. har utarbeidet en komplett dyrkningsmedium som inneholder en høyere mengde av aminosyrer (essensielle og ikke-essensiell), fremmer opprettholdelse av akinærceller i differensiert tilstand. Et slikt medium kan være meget nyttig hvis man ønsker å kultur akinærceller isolert ved denne metoden i mer enn 10 dager.
En annen parameter som kan modifiseres hvis langvarig kultur er nødvendig, er pH i kulturmediet. Fysiologisk, er den apikale polen akinærceller i kontinuerlig kontakt med bikarbonat-rik, svakt alkalisk væske som gir opphav til bukspyttkjertelen juice. Det er fristende å spekulere i at pH i acinar celle miljøet kan være viktig for å opprettholde acinar differentiation tilstand. Noen protokoller tidligere rapporterte bruken av et dyrkingsmedium med en pH justert til 7,8 for å etterligne de "innledende" fysiologi av akinærceller 19.
Betydningen av teknikk
Det er viktig å nevne at det finnes andre protokoller for dyrking akinærceller, ved hjelp av bukspyttkjertelen eksplanter og organotypic kulturer 19. Deres anvendelse er basert på pankreatisk cellemigrasjon fra explant til membranen på hvilken de dyrkes, er vanskeligere. Isolering av disse bukspyttkjertelen celler krever særlig en første uken i bukspyttkjertelen eksplantering kultur. Den store fordelen med denne fremgangsmåten er at ingen enzymatisk dissosiasjon er nødvendig, slik at både membran integritet og celle-til-celle-interaksjoner, bevares. Under disse betingelser kan akinærceller bli opprettholdt in vitro i opptil 14 dager. Likevel acinar cellekultur innhentet er ikke ren, og forurensninger fibroblaster, ductal calen, og endotelceller er uunngåelig stede, som kan være uforenlig med enkelte typer eksperimenter. I kontrast, gir vår prosedyre raskt en ren populasjon av akinærceller, bevare sin opprinnelige arkitektur av acini.
Dorrell et al. Beskrevet en annen fremgangsmåte for å isolere de forskjellige mus pancreatic celletyper (inkludert acinøs, kanalsystem, og endokrine celler), ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) 17. Denne metoden er meget effektiv for å oppnå en ren (eller spesifikk) populasjon av akinærceller. Men det krever et fluorescerende merking med spesifikke antistoffer, før sortering. Dessuten krever denne prosedyren også en kompetanse i FACS og et flowcytometer. Dessuten gjør denne teknikken ikke tillate en utvidet kultur akinærceller, på grunn av tap av sin opprinnelige arkitektur acini. Vår raske metoden gir en utvidet in vitro kultur spredt akinærceller med en kvalitet og en renhet som enre kompatibel med de fleste av ytterligere rutine applikasjoner.
Fremtidige søknader
Når mestret, bør denne teknikken for å isolere / dyrking akinærceller vise seg svært nyttig i å ta en rekke spørsmål og særlig for å undersøke mekanismene som er involvert i bukspyttkjertelen plastisitet og transdifferentiation, som er godt kjent, men dårlig forstått. Ved å bevare noen inter-og intracellulær kommunikasjon, spredt dette acini modellen forblir mer fysiologisk relevant enn udødeliggjort cellelinjer.
I feltet av bukspyttkjertelen tumorigenesis, gir denne primære cellemodell et tilfredsstillende system for å studere acinar celle transdifferentiation, en av mekanismene som foreslås for å generere aggressive bukspyttkjertelen kreft. Selv udødeliggjort menneskelige eller murine cellelinjer (for eksempel Colo357, Panc-en, eller BxPC3) kan være mer fleksible i bruk enn primære akinærceller, både sin opprinnelse og deres komplex genetisk status (som transformerte cellelinjer opprinnelig isolert fra svulster i bukspyttkjertelen eller bukspyttkjertelen metastaser) utgjør store ulemper i å studere slike mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker de ansatte i AniCan (CrCL, Lyon) for deres hjelp i forbindelse med dyr omsorg. Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale (INSERM Avenir Program), Ligue Nationale Contre le Cancer, av Association pour la Recherche sur le Cancer, ved Institut National du Cancer, og ved stipend fra Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), fra Institut National du Cancer (JG), fra Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche i Frankrike (RMP og DFV) og fra Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L.
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
